戊型肝炎病毒亞基因組RNA的研究.pdf

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1、!"卷#期微生物學(xué)報&’()!"0’)#$"""年%$月!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$*+,+-.+/$"""!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!戊型肝炎病毒亞基因組607的研究夏小兵"黃如統(tǒng)李德榮（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所北京%""89"）摘要：本文利用同位素代謝標記在:;&感染8<9!%"<9，#<9!2<9=分別檢測到%及$個亞基因組607，而感染$%=后及在成熟的病毒顆粒內(nèi)未能檢測到亞基因組607。通過

2、雜交實驗，發(fā)現(xiàn):;&的亞基因組607具有典型的共4>端的半套式結(jié)構(gòu)，且基因組607與亞基因組607的9>端不存在共同的引導(dǎo)序列。通過紫外轉(zhuǎn)錄圖譜發(fā)現(xiàn):;&的亞基因組607是通過獨立轉(zhuǎn)錄的方式產(chǎn)生的。利用引物延伸反應(yīng)發(fā)現(xiàn)兩種亞基因組607的轉(zhuǎn)錄起始位點分別位于607聚合酶區(qū)及非結(jié)構(gòu)區(qū)、結(jié)構(gòu)區(qū)的基因間序列。關(guān)鍵詞：戊型肝炎病毒，亞基因組607，紫外轉(zhuǎn)錄圖譜中圖分類號：6424文獻標識碼：7文章編號："""%5#$"1（$"""）"#5"#$$5$2許多正鏈607病毒的非結(jié)構(gòu)基因位于基因組的9>部分，結(jié)構(gòu)基因

3、位于基因組的4>部分，基因組由多個開放閱讀框架（’?+@/+ABC@DE/A-+，F(xiàn)6G）組成。這些病毒在感染細胞內(nèi)除合成基因組607外，還轉(zhuǎn)錄亞基因組607（HI.D+@’-C,607）［%］?；蚪M607用于翻譯病毒的非結(jié)構(gòu)蛋白，而亞基因組607主要用于指導(dǎo)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白的合成。通過亞基因翻譯策略，使得正鏈607病毒可以在轉(zhuǎn)錄水平上獨立地調(diào)節(jié)病毒結(jié)構(gòu)蛋白與非結(jié)構(gòu)蛋白在復(fù)制不同階段的合成。戊型肝炎病毒（:+?AJCJCH;&C/IH，:;&）是一基因組長約2<9K.的正鏈607病毒，具有典型的能合成亞

4、基因組607的結(jié)構(gòu)特征。LA-等［$］在感染:;&的食蟹猴肝組織中檢測到了:;&亞基因組607，但利用動物實驗研究病毒復(fù)制具有一定局限性，因此本研究利用:;&（827）能適應(yīng)于細胞培養(yǎng)的特點，進一步探討了:;&亞基因組607的結(jié)構(gòu)及產(chǎn)生特征。!材料和方法!)!材料!)!)!病毒、細胞：:;&（827）毒株及79!1細胞系均為本室保存。!)!)"寡核苷酸探針（引物）：根據(jù)發(fā)表的:;&緬甸株序列，合成了三個寡核苷酸探針，序列分別為F(CD’7：9>7MMN7M7NN7N7L7LMLMMLNM7（%!$!@J

5、）F(CD’O：9>7LM77LLN7MMMNNNN77LLNLLNL（!82#!!891@J）F(CD’N：9>7M77MNLLNNMLMMNN7LL7L7LM（9##4!#88#@J）F(CD’*：9>NNMMLMLL7L777NLLNLMMMN7L（%$99!%$12@J）作者簡介：夏小兵（%12%3），男，江西省永新縣人，博士，現(xiàn)工作單位：解放軍4"$醫(yī)院基因治療研究中心，助理研究員，主要從事微生物學(xué)及生物工程的研究收稿日期：%1115%"5%$，修回日期：$"""5"!5%"E期夏小兵等：戊型

6、肝炎病毒亞基因組%&’的研究E*)!!"方法)*!!"!!"#$%&’(的［+］摻入標記：’,-.細胞在培養(yǎng)皿上長成單層后，換成無磷/0#0培養(yǎng)基，過夜，接種病毒（121,034），)56吸附78，用無磷培養(yǎng)基洗)次，加入無磷的/0#0維持培養(yǎng)基，感染到所需時間后，向維持液內(nèi)加入放線菌素/（終濃度為)*71!9／:;），作用78，傾去維持液，再加入含71!9放線菌素/與711<=>［+］正磷酸鹽維持液7:;，繼續(xù)培養(yǎng)7"*8。經(jīng)以上過程處理的正常細胞，放射自顯影基本檢測不到核酸信號。!!"!"液相雜交：

7、正常及感染細胞的總%&’在03+?緩沖液中與標記的寡核苷酸探針.-6變性,:>@，于,16緩慢退火)8，在03+?緩沖液中進行非變性膠電泳，電泳結(jié)束后，干膠直接進行放射自顯影分析。!!"!#紫外（A$）照射實驗：經(jīng)磷饑餓（即無磷酸鹽培基）及放線菌素/處理的感染細胞，倒掉培養(yǎng)液并打開培養(yǎng)皿蓋，在距)1B紫外燈71C:下照射后，加入含71／:;放線!9菌素/及711<=>／:;的［)*+］正磷酸鹽的無磷維持液孵育7"*8。!!"!$蛋白合成抑制實驗：經(jīng)過磷饑餓及放線菌素/處理的"#$（D5’）感染細胞，加入

8、終濃度為711／:;的放線菌酮、71／:;的放線菌素/作用78，繼續(xù)補加711<=>／:;!9!9的［)*+］正磷酸鹽培養(yǎng)78。!!"!%%&’的電泳：采用甲醛變性膠電泳，E16干膠，同時加入變性后的核酸分子量標準，電泳結(jié)束后切下分子量標準，溴化乙啶（#F）染色，將各條帶所代表的大致分子量按7G7繪到白紙上，用于%&’放射自顯影后分子量的大致觀察。)*!!"!&引物延伸："#$特異引物經(jīng)過［+］末端標記后，以總%&’為模板進行逆轉(zhuǎn)錄。用DH