稀土離子誘導(dǎo)鈣調(diào)蛋白構(gòu)象變化后的單克隆抗體制備.pdf

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1、Vol.23高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報No.42002年4月C~EMICALJOURNALOFC~INESEUNIVERSITIES526~529稀土離子誘導(dǎo)鈣調(diào)蛋白構(gòu)象變化后的單克隆抗體制備李偉國1祁超12杜麗2劉仔2趙大慶1(1.中國科學(xué)院長春應(yīng)用化學(xué)研究所稀土化學(xué)與物理開放實(shí)驗(yàn)室長春130022;2.中國人民解放軍軍需大學(xué)生物化學(xué)教研室長春130062D摘要采用單克隆抗體技術(shù)研究了三價稀土離子與鈣調(diào)蛋白作用后對其與靶分子識別能力的影響.牛腦鈣調(diào)蛋白經(jīng)24-二硝基氟苯修飾后再結(jié)合三價的銪離子然后免疫Balb/c小鼠經(jīng)過3次免疫后在小鼠血

2、清中檢測到相應(yīng)的抗體抗體效價為1=12000;用雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備出一株抗鈣調(diào)蛋白的單克隆抗體細(xì)胞株2C3;酶聯(lián)免疫吸附法(ELISAD測定結(jié)果證實(shí)鈣調(diào)蛋白結(jié)合稀土離子前后對該抗體的識別能力存在顯著差異表明該抗體可以用于進(jìn)一步研究金屬離子對鈣調(diào)蛋白構(gòu)象變化及其對靶分子識別的影響.關(guān)鍵詞鈣調(diào)蛋白;稀土離子;單克隆抗體中圖分類號G939.91文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號0251-0790(2002D04-0526-04鈣調(diào)蛋白(CaMD是生物體內(nèi)一種主要的鈣離子受體也是一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白它參與許多細(xì)胞代謝調(diào)控過程調(diào)節(jié)著30多種酶的活性(如環(huán)

3、核苷酸磷酸二酯酶鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶腺苷酸環(huán)化酶等D[1].研究表明鈣調(diào)蛋白的調(diào)控作用是在胞內(nèi)的鈣離子介導(dǎo)下進(jìn)行的即它首先與鈣離子結(jié)合誘導(dǎo)出自身的構(gòu)象變化暴露出肽鏈表面的疏水基團(tuán)然后與靶酶分子作用進(jìn)而調(diào)控它們的活性.三價稀土離子具有和鈣離子相近的離子半徑和配位化學(xué)環(huán)境它們進(jìn)入生物體內(nèi)后通常與含鈣的生物配體或鈣結(jié)合的生物大分子作用影響著它們生理功能的發(fā)揮.文獻(xiàn)[2]報道稀土離子進(jìn)入生物體內(nèi)后對生物體往往表現(xiàn)出一種~ormesis'效應(yīng)即低濃度的稀土對生物體生長有一定的刺激作用離子濃度較高時則表現(xiàn)出抑制作用.有關(guān)研究[3]也表明高濃度的稀土

4、離子和CaM作用后通常會抑制CaM靶酶的活性其原因可能在于稀土離子與CaM結(jié)合后改變了CaM的構(gòu)象進(jìn)而影響到它與靶酶的作用.圓二色譜結(jié)果[4]證實(shí)稀土離子與CaM結(jié)合后使其二級結(jié)構(gòu)中的O螺旋含量減少(比結(jié)合2+時少D.Ca通常一個生物大分子正常生理功能的發(fā)揮除了與其二級結(jié)構(gòu)有關(guān)以外更主要的是由其高級結(jié)構(gòu)來決定.有關(guān)稀土離子與CaM的研究僅限于結(jié)合位點(diǎn)的考察[5]而它們對CaM三級結(jié)構(gòu)的影響尤其是它們與CaM作用后對其與靶分子識別的影響尚鮮見文獻(xiàn)報道.為了考察稀土離子與鈣離子對CaM三級結(jié)構(gòu)變化影響的差異本文采用免疫化學(xué)的方法制備出

5、了三價銪離子(Eu3+D誘導(dǎo)的CaM特定構(gòu)象變化后的單克隆抗體初步研究了該抗體與不同抗原分子識別能力的差異.1實(shí)驗(yàn)部分1.1材料和儀器苯基-瓊脂糖和G-25瓊脂糖凝膠為Pharmacia公司產(chǎn)品;二乙氨基乙基-纖維素(DEAE-52D離子交換樹脂購自Whatman公司;乙二醇-雙(2-氨乙基D四乙酸(EGTAD為Sigma公司產(chǎn)品24-二硝基氟苯購自Acros公司;Eu為珠江冶煉廠產(chǎn)品使用時用濃鹽酸溶解配成p~為5~6的2O3(99.99%D收稿日期:2001-06-28.基金項目:國家自然科學(xué)基金重大項目(批準(zhǔn)號:2989028

6、0D資助.聯(lián)系人簡介:趙大慶(1963年出生D男博士研究員博士生導(dǎo)師主要從事生物無機(jī)化學(xué)研究.No.4李偉國等:稀土離子誘導(dǎo)鈣調(diào)蛋白構(gòu)象變化后的單克隆抗體制備5Z7溶液備用.Balb/c小鼠購自衛(wèi)生部長春生物制品所;SpZ/0骨髓瘤細(xì)胞由中國人民解放軍軍需大學(xué)提供;酸度計和EASYpUreRF純水系統(tǒng)均為美國Cole-Parmer公司產(chǎn)品.1.2實(shí)驗(yàn)方法1.Z.1CaM的制備CaM的分離和純化參照文獻(xiàn)[6]的方法,分別用DEAE-5Z陰離子交換和苯基-瓊脂糖疏水親和兩步柱層析法從牛腦中分離得到,SDS-PAGE電泳結(jié)果證明為一條帶

7、,分子量為17000(見圖1).CaM的脫鈣采用超濾法:將5mgCaM溶于10mLTris-~Cl(50mmol/L,p~=7.5,含Zmmol/LEGTA)緩沖液中,離心除去不溶物,然后轉(zhuǎn)入50mL的超濾杯中,用截留分子量為1000的超濾膜于1.5>105Pa的條件下超濾濃縮至ZmL后,補(bǔ)加10mL緩沖液繼續(xù)超濾,如此反復(fù)3次,再換用10mL的去離子水超濾,反復(fù)4次.殘留的鈣用原子吸收光譜法測定.蛋白濃度用Lowry法[7]fig.1SDS-PAGeofpurifiedbovinecaM測定,以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白.最后將制

8、備的脫鈣蛋白(apo-CaM)凍干保存.1.Z.Z抗原的修飾取3.5mg已脫鈣的蛋白溶于300ML去離子水,然后加入100ML0.7mol/L的Na~CO3和Z00MLZ,4-二硝基氟苯,于室溫下反應(yīng)40min,每隔5min在振蕩混合器上振蕩1次.