安捷倫1260高效液相色譜培訓(xùn)20130305

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1、設(shè)備培訓(xùn)-----高效液相色譜2013.05.14概述高效液相色譜法（HPLC）是20世紀(jì)60年代末70年代初發(fā)展起來的一種新型分離分析技術(shù)，隨著不斷改進(jìn)與發(fā)展，目前已成為應(yīng)用極為廣泛的化學(xué)分離分析的重要手段。它是在經(jīng)典液相色譜基礎(chǔ)上，引入了氣相色譜的理論，在技術(shù)上采用了高壓泵、高效固定相和高靈敏度檢測器，因而具備速度快、效率高、靈敏度高、操作自動化的特點(diǎn)。色譜原理色譜法的分離原理是：溶于流動相(mobilephase)中的各組分經(jīng)過固定相時由于與固定相(stationaryphase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同在固定相中滯留時間不同從而先后從固

2、定相中流出。又稱為色層法、層析法高效液相色譜儀高效液相色譜儀的結(jié)構(gòu)：一般可分為5個主要部分：高壓輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、色譜分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)。其工作過程如下：首先高壓泵將貯液器中流動相溶劑經(jīng)過進(jìn)樣器送入色譜柱，然后從控制器的出口流出。當(dāng)注入欲分離的樣品時，流經(jīng)進(jìn)樣器貯液器的流動相將樣品同時帶入色譜柱進(jìn)行分離，然后依先后順序進(jìn)入檢測器，記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來，由此得到液相色譜圖。一、高壓輸液系統(tǒng)由于高效液相色譜所用固定相顆粒極細(xì)，因此對流動相阻力很大，為使流動相較快流動，必須配備有高壓輸液系統(tǒng)。它是高效液相色譜儀最重要的部件，一般由儲液裝置、脫氣裝置、高壓輸液泵、過

3、濾器等組成，其中高壓輸液泵是核心部件。輸液泵分為恒流泵和恒壓泵兩種，但是目前恒流泵已經(jīng)基本取代了恒壓泵。1、輸液泵應(yīng)具備性能:A、流量穩(wěn)定，其變異系數(shù)應(yīng)小于0.5%，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；B、流量范圍寬，分析型應(yīng)該在01-10mL/min范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到100mL/min；C、輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到150-300kgf/cm2（kgf/cm2=98.0665kpa）；D、液缸溶劑??；E、密封性好，耐腐蝕。2、輸液泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng)A、防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m?；蚱渌魏坞s質(zhì)微粒都能磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒；

4、B、流動相不應(yīng)含有任何腐性物質(zhì)含有緩沖液的流動相不應(yīng)保留在柱內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果含有緩沖溶液的流動相在柱內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體。這些晶粒將損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，儀器在關(guān)機(jī)前必須將泵清洗干凈，再換成適合色譜柱保存的和有利于泵維護(hù)的溶劑。C、泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。D、輸液泵的最高壓力不要超過規(guī)定的最高壓力值，否則會使高壓密封環(huán)變形。E、流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定。二、進(jìn)樣系統(tǒng)高效液相色譜柱比氣相色譜柱短得多（約5～30cm）

5、，所以柱外展寬（又稱柱外效應(yīng)）較突出。柱外展寬是指色譜柱外的因素所引起的峰展寬，主要包括進(jìn)樣系統(tǒng)、連接管道及檢測器中存在死體積。柱外展寬可分柱前和柱后展寬。進(jìn)樣系統(tǒng)是引起往前展寬的主要因素，因此高效液相色譜法中對進(jìn)樣技術(shù)要求較嚴(yán)。1、進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn)樣，進(jìn)樣時對色譜柱系統(tǒng)的壓力、流量影響小。2、進(jìn)樣方式：隔膜泵進(jìn)樣、停留進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動進(jìn)樣。三、色譜分離系統(tǒng)色譜分離系統(tǒng)包括：色譜柱、固定相和流動相。其中，色譜柱是其核心部分。1、色譜柱的構(gòu)造色譜柱由柱管、壓帽、卡套（密封環(huán)）、篩板（濾片）、接頭、螺絲等組成。柱管材料有玻璃、不銹鋼、鋁、銅及內(nèi)襯光滑

6、的聚合材料的其他金屬。玻璃管耐壓有限，故金屬管用得較多。2、色譜柱的類型色譜柱按照用途分為分析型和制備型兩類。a、常規(guī)分析柱（常量柱）一般色譜柱長10～30cm，內(nèi)徑為2～5mm（常量4.6mm，國內(nèi)有4mm和5mm），凝膠色譜柱內(nèi)徑3～12mm，制備往內(nèi)徑較大，可達(dá)25mm以上。b、窄徑柱（細(xì)管徑柱、半微量柱）柱長10～30cm，內(nèi)徑1～2mmc、毛細(xì)管柱（微柱）內(nèi)徑0.2～0.5mmd、半制備柱，內(nèi)徑>5mm。e、實(shí)驗(yàn)室制備柱，柱長10～30cm，內(nèi)徑20～40mmf、生產(chǎn)制備柱，內(nèi)徑可達(dá)幾十厘米。注：一般在分離前備有一個前置柱，前置柱內(nèi)填充物和分離柱完全一樣，這樣可使淋洗溶劑

7、由于經(jīng)過前置柱為其中的固定相飽和，使它在流過分離柱時不再洗脫其中固定相，保證分離技的性能不受影響。3、色譜柱的使用和注意事項(xiàng)A、避免溫度和壓力的急劇變化及任何機(jī)械振動。溫度的突然變化或者使色譜柱從高處掉下會影響柱內(nèi)的填充情況；柱壓突然升高或降低也會沖動柱內(nèi)填料，因此在調(diào)節(jié)流量時應(yīng)該緩慢進(jìn)行，在閥進(jìn)樣時閥的轉(zhuǎn)動不能過緩。B、應(yīng)逐漸改變?nèi)軇┙M成，特別是反相色譜中，不應(yīng)直接從有機(jī)溶劑改為全部是水，反之亦然。C、一般情況下色譜柱不能反沖，只有生產(chǎn)者指明