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1、一、做ELISA確定抗原最佳包被濃度，做方陣滴定具體怎么做呢？選擇好一份已知為陽性和陰性背景的標本，將你的抗原用1*CBPH=9.6或1*PBPH=7.4進行倍比稀釋（8個條件）后加入96孔板每孔100ul。（一般包被濃度100ng抗原或抗體/孔，最優(yōu)包被條件需進行試驗選擇）4度過夜取出后甩干，加入20%NBS封閉每孔200ul。37度2h熱封，甩去后拍干即可。將你HRP或AP標記的抗原或二抗用酶標稀釋液進行稀釋（倍比稀釋4個梯度）即可。棋盤滴定就是板酶交叉,同時帶上陽性、陰性通過試驗確定最佳P/N的包被搭配E的試驗2．抗
2、原和抗體最佳工作濃度的確定?抗原抗體反應(yīng)要求在最適比例條件下進行，ELISA反應(yīng)試劑多，其工作濃度不同對結(jié)果影響較大，因此必須對包被抗原(抗體)和酶標抗體(抗原)進行最佳工作濃度的滴定和選擇，以達到最佳的測定條件。? 1）方陣(棋盤)滴定法選擇包被抗原的工作濃度用包被液將抗原作一系列稀釋(1:50～l:800)后，按行進行包被、洗滌。按列分別加入用稀釋液1:100稀釋的強陽性、弱陽性、陰性參考血清及稀釋液(作空白對照)，保溫，洗滌。加工作濃度酶標抗體，洗滌，加底物顯色，加酸終止反應(yīng)后讀取A值。選擇強陽性參考血清A值；為0
3、．8左右，陰性參考血清A值<0．1的包被抗原稀釋度為工作濃度。? 方陣(棋盤)法選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度將抗體用包被液稀釋為10mg／L、lmg／L、0.1mg／L三個濃度按行包被，每一個濃度包被三行(每行3孔)，分別在每個濃度包被的第一、二、三行中分別加入強陽性抗原，弱陽性抗原和陰性對照，將酶標抗抗體用稀釋液稀釋為1:l000、l:5000、l:10000三個濃度，分別加入每個濃度包被的第一、二、三列中。加底物顯色，加酸終止反應(yīng)，分別讀取A值。以強陽性抗原液A值在0.8左右，陰性參考A值<0.1的條件為最適條件
4、。據(jù)此選擇包被抗體和酶標抗體的最佳工作濃度。?二、ELISA最適工作濃度的選擇及標準化操作1最適工作濃度的選擇?1．1間接法測抗體?????酶標抗體工作濃度的選擇：①用IgG進行包被，洗滌。②將酶標IgG用稀釋液作一系列稀釋后分別加入已包被的孔中，保溫、洗滌。③加酸終止反應(yīng)后，讀取吸光度(A)。讀取A值在1．0時的酶標抗體稀釋度，作為酶標抗體的工作濃度。該酶標IsC的工作濃度應(yīng)為1／1?600。?????棋盤滴定法選擇包被抗原工作濃度：①用包被液將抗原由1：50開始作比倍稀釋后進行包被，洗滌。②將強陽性參考血清、弱陽性參考
5、血清和陰性參考血清用稀釋液作1：100稀釋，加樣，保溫、洗滌。③加按工作濃度稀釋的酶標IsC抗體，保溫、洗滌。④加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后讀取A值。⑤選擇強陽性參考血清的A值為0．8左右、陰性參考血清的A值小于0．1的包被抗的稀釋度作為工作濃度，從中選取最適工作濃度。?1．2夾心法測抗原?????在夾心ELISA法中，可用棋盤滴定法同時選擇包被抗體和酶標抗體的工作濃度。①抗體免疫球蛋白用包被緩沖液稀釋至蛋白濃度為10．0、1．0和0．1微克／毫升，分別在ELISA板上進行包被，每一濃度包括3個縱行，洗滌。②在1個橫行各包被
6、孔中加入強陽性抗原液，另1橫行加入弱陽性抗原液，第3橫行加入陰性對照液，保溫、洗滌。③將酶標抗體用稀釋液稀釋成3個濃度，例如1：1?000、1：5?000和1：25000。分別加入每個包被濃度的1個縱行中，保溫、洗滌。④加底物顯色。加酸終止反應(yīng)后，讀取A值。⑤以強陽性抗原的A值在0．8左右、陰性參考的A值小于0．1的條件作最適條件，據(jù)此選擇包被抗體和酶抗體的工作濃度，從中選取包被抗體濃度和酶標抗體的稀釋度。為了進一步節(jié)省試劑，可以此濃度為基點，縮小間距再進一步做棋盤滴定。?2測定方法的標準化?2．1加樣?????ELISA
7、中除了包被外，一般需進行96孔加樣。定性測定中有時不強調(diào)加樣量的準確性。例如規(guī)定為加樣1滴，如不具備相當(dāng)?shù)臈l件，要盡量使用相同口徑的滴管，保持準確的加樣姿勢，使每滴液體的體積基本相同。在定量測定中，加樣量應(yīng)力求準確，最好采用量程準確的微量移液器。加樣時應(yīng)將液體加在孔底，不要加在孔壁上部，避免出現(xiàn)氣泡。?2．2保溫?????在ELISA中，一般在加標本和結(jié)合物后，反應(yīng)的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定的要求，保溫容器最好是水浴箱，可使溫度迅速平衡。各ELISA板不應(yīng)疊在一起。為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，或?qū)迤椒旁诘撞繅|有濕紗布的濕盒中。如用
8、保溫箱，空濕盒應(yīng)預(yù)先放在其，以平衡溫度。?2．3洗滌?????洗滌在ELISA過程中不是反應(yīng)步驟，但卻是決定實驗成敗的關(guān)鍵。在標本和結(jié)合物的稀釋液和洗滌液中加入聚山梨酯一類物質(zhì)即避免非特異性吸附，在ELISA中最為常用。ELISA板的洗滌一般可采用以下方法：吸干孑L內(nèi)反應(yīng)液；將洗滌液注滿板孔；放置2分鐘
