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《行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)：DB33T 2247-2020 鴨坦布蘇病毒RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測方法.pdf》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、ICS65.020.30B43DB33浙江省地方標(biāo)準(zhǔn)DB33/T2247—2020鴨坦布蘇病毒RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測方法MethodofRT-PCRandthereal-timeRT-PCRforthedetectionofducktembusuvirusdisease2020-03-03發(fā)布2020-04-03實施浙江省市場監(jiān)督管理局發(fā)布DB33/T2247—2020前言本標(biāo)準(zhǔn)按照GB/T1.1-2009給出的規(guī)則編寫。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省農(nóng)業(yè)農(nóng)村廳提出。本標(biāo)準(zhǔn)由浙江省畜牧獸醫(yī)和飼料標(biāo)準(zhǔn)化技術(shù)委員會歸口。本標(biāo)準(zhǔn)起草單位：浙
2、江省動物疫病預(yù)防控制中心、浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所。本標(biāo)準(zhǔn)主要起草人：云濤、徐輝、周彩琴、張存、趙靈燕、余斌、吳赟竑、張傳亮、吳雪軍、黃曉兵、馮肖肖、華炯鋼、呂見濤、張娟敏、鮑偉華。IDB33/T2247—2020鴨坦布蘇病毒RT-PCR和實時熒光定量RT-PCR檢測方法1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了鴨坦布蘇病毒的反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）和實時熒光定量RT-PCR的實驗條件、操作步驟和結(jié)果判定等要求。本標(biāo)準(zhǔn)適用于鴨坦布蘇病毒核酸的檢測。2術(shù)語和定義2.1鴨坦布蘇病毒（DuckTembusuVirus，DTMUV）屬于黃病毒科、黃病
3、毒屬、蚊媒病毒類、Ntaya病毒群，可引起鴨、鵝產(chǎn)蛋下降，雛鴨、雛鵝發(fā)病死亡。3實驗條件3.1主要儀器設(shè)備3.1.1PCR儀。3.1.2熒光定量PCR儀。3.1.3微量移液器。3.1.4組織勻漿器。3.1.5電泳儀。3.1.6電泳槽。3.1.7水浴鍋。3.1.8紫外凝膠成像系統(tǒng)。3.1.9高速臺式低溫離心機。3.1.10生物安全柜。3.2試劑3.2.10.01M磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，pH7.4PBS）：稱取8.0gNaCl、0.2gKCl、2.9gNa2HPO4?12H2O、0.2gKH2PO4，將上述試劑溶于800mL去離子
4、水中，充分?jǐn)嚢枞芙?，滴加濃鹽酸將pH調(diào)節(jié)至7.4，然后加去離子水定容至1L，高溫滅菌30min，室溫保存。3.2.2氯仿。3.2.3異丙醇。3.2.4焦炭酸二乙酯（DEPC）處理的滅菌去離子水：用DEPC50μL，加超純水至100mL，室溫過夜，121℃高壓滅菌15min，分裝到1.5mLDEPC處理過的離心管，凍存?zhèn)溆谩?.2.575%乙醇：取新開啟的無水乙醇75mL，加DEPC水至100mL，混勻，-20℃預(yù)冷。1DB33/T2247—20203.2.6溴化乙錠（EB）：取1.0g溴化乙錠，加去離子水，定容至100mL。充分溶解后的溴
5、乙錠溶液轉(zhuǎn)移至棕色瓶中，室溫避光保存，其工作濃度為0.5μg/mL。3.2.71×TAE緩沖液：取242g羥基甲基氨基甲烷（Tris）、37.2g二水乙二銨四乙酸二鈉、57.1mL冰乙酸，加去離子水定容至1L，配置成50×TAE電泳緩沖液；量取20mL的50×TAE電泳緩沖液，加入去離子水定容至1L，室溫保存。3.2.81%瓊脂糖凝膠：稱取1.0g瓊脂糖，加入1×TAE電泳緩沖液100mL，輕輕混勻后加熱，使瓊脂糖完全熔化。待瓊脂糖膠冷至50℃～60℃時，加EB溶液（終濃度0.5μg/mL）或5μL核酸染料，搖勻后倒入制膠板中，厚度為3m
6、m～5mm，室溫凝固后取下電泳梳子，備用。3.2.9DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物Marker：DL2000。3.2.1010×加樣緩沖液：稱取25g聚蔗糖、0.1g溴酚藍、0.1g二甲苯青，加入滅菌雙蒸水定容至100mL。3.2.11商品化的一步法實時熒光RT-PCR反應(yīng)試劑盒。OneStepPrimeScript?RT-PCRKit（PerfectRealTime，TAKARA)，含有RT-PCR緩沖液，酶混合物，dNTP混合物，無RNA酶的水等。3.2.12M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶。3.2.13RNA酶抑制劑。3.2.14TaqDNA聚合酶。3
7、.2.15dNTPs。3.2.16引物：RT-PCR擴增引物,見表1；實時熒光定量RT-PCR引物和探針，見表2。表1RT-PCR擴增引物引物名稱引物序列DTMUV引物P15'-GCAACCAGGCAAAGAGGTCATA-3'DTMUV引物P25'-AAGTGAGCCTCATCCATAATGAACA-3'表2實時熒光定量RT-PCR引物和探針引物名稱引物序列(5'-3')DTMUV引物P3AAGTCAGGCCAGGGAATCCDTMUV引物P4CATGCACCCAGATTTGTTAACCDTMUV探針FAM-CCGTCATCCAACAT
8、C-MGB4操作步驟與結(jié)果判定4.1樣品采集與處理4.1.1組織器官5.1.1.1用無菌鑷子和剪刀采集患病或病死禽類各種組織與器官（肝臟、卵巢、腦、脾臟、胸腺等），裝入一次性塑料袋或其它滅菌容
