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1、第七章親和層析法第一節(jié)基本原理生物親和作用：生物物質(zhì)具有識別特定物質(zhì)并與該物質(zhì)的分子相結(jié)合的能力。這種識別并結(jié)合的能力具有排他性（能區(qū)分結(jié)構(gòu)和性質(zhì)非常相近的其它分子）。親和層析(AffinityChromatography，AC)是利用生物大分子具有對一類生物大分子特異識別和可逆結(jié)合的特性而建立起來的一種分離的色譜方法，也叫做生物親和或生物特異性親和色譜。親和作用的機(jī)理1、結(jié)構(gòu)特點(diǎn)（必要條件）：存在凹陷和凸起結(jié)構(gòu)（鑰匙和鎖孔的關(guān)系）2、相互作用力的存在靜電作用氫鍵疏水性相互作用配位鍵弱共價鍵影響親和作用的因素1、離子強(qiáng)度：一般來說，提高離子強(qiáng)度，親
2、和作用減弱或完成破壞。2、PH：在適當(dāng)?shù)腜H下，親和結(jié)合作用較高，在其它PH下，親和作用減弱或完成破壞。3、抑制氫鍵形成的物質(zhì)：脲和鹽酸胍的存在可減弱親和作用4、溫度：提高溫度，靜電作用、氫鍵、配位鍵減弱；但是，疏水性相互作用增強(qiáng)5、液體離子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相互作用減弱6、螯合劑：影響配位鍵，使親和作用消失1910年最早利用親和純化原理分離蛋白質(zhì)(不溶性淀粉吸附淀粉酶)。20世紀(jì)50年代有意識的利用。1967年親和純化技術(shù)從理論走向?qū)嵱?BrCN活化法修飾糖類載體用以偶聯(lián)伯胺類化合物)。80年代以后，生物親和作用和其它分離
3、技術(shù)的結(jié)合。親和層析已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物分子的分離和純化，如結(jié)合蛋白、酶、抑制劑、抗原、抗體、激素、激素受體、糖蛋白、核酸及多酶類等；也可以用于分離細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒等。親和層析的基本特點(diǎn)1、純化過程簡單、迅速，且分離效率高2、特別適用于分離純化一些含量低、穩(wěn)定性差的生物大分子3、純化倍數(shù)大，產(chǎn)物純度高4、必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件5、價格相對較昂貴；6、在洗脫中，交聯(lián)在層析介質(zhì)上的配基可能脫落并進(jìn)入產(chǎn)品中，從而造成不良影響，如抗體、染料等配基。親和層析原理親和吸附介質(zhì)：基質(zhì)+配體★親和的一對分子中的一方以共價鍵形式與不溶
4、性載體相連作為固定相吸附劑★當(dāng)含有混合組份的樣品（流動相）通過此固定相時，只有和固定相分子有特異親和力的物質(zhì)，才能被固定相吸附結(jié)合，其它沒有親和力的無關(guān)組份就隨流動相流出★然后改變流動組成份，將結(jié)合的親和物洗脫下來第二節(jié)操作一、基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)符合下面的要求：1．極低的非特異性吸附。2．高度的親水性。3．較好的理化穩(wěn)定性。4．大量的化學(xué)基團(tuán)能被有效地活化，而且容易和配體結(jié)合。5．適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。一般親和吸附劑采用的基質(zhì)有纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖、多孔玻璃珠等。sepharose4B具有層析速度較快，化學(xué)穩(wěn)定性好，非
5、特異吸附少，微球孔徑適度，蛋白載量大的特點(diǎn)，并且有大量可供活化的羥基，是親合層析的理想介質(zhì)。二、配體的選擇理想的配體應(yīng)具有以下一些性質(zhì)：1)配體與待分離的物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力。親和力太弱，待分離物質(zhì)不易與配體結(jié)合，造成親和層析吸附效率很低。而且吸附洗脫過程中易受非特異性吸附的影響，引起分辨率下降。但如果親和力太強(qiáng)，待分離物質(zhì)很難與配體分離，這又會造成洗脫的困難?？傊?，配體和待分離物質(zhì)的親和力過弱或過強(qiáng)都不利于親和層析的分離。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求盡量選擇與待分離物質(zhì)具有適當(dāng)?shù)挠H和力的配體。2)配體與待分離的物質(zhì)之間的親和力要有較強(qiáng)的特異性，也就是說配體與待分
6、離物質(zhì)有適當(dāng)?shù)挠H和力，而與樣品中其它組分沒有明顯的親和力，對其它組分沒有非特異性吸附作用。這是保證親和層析具有高分辨率的重要因素。3)配體要能夠與基質(zhì)穩(wěn)定的共價結(jié)合，在實(shí)驗(yàn)過程中不易脫落，并且配體與基質(zhì)偶聯(lián)后，對其結(jié)構(gòu)沒有明顯改變，尤其是偶聯(lián)過程不涉及配體中與待分離物質(zhì)有親和力的部分，對二者的結(jié)合沒有明顯影響。4)配體自身應(yīng)具有較好的穩(wěn)定性，在實(shí)驗(yàn)中能夠耐受偶聯(lián)以及洗脫時可能的的較劇烈的條件，可以多次重復(fù)使用。根據(jù)配體對待分離物質(zhì)的親和性的不同，可以將其分為兩類：特異性配體（specificligand）和通用性配體（generalligand）。
7、特異性配體一般是指只與單一或很少種類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體。如生物素和親和素、抗原和抗體、酶和它的抑制劑、激素－受體等，它們結(jié)合都具有很高的特異性，用這些物質(zhì)作為配體都屬于特異性配體。配體的特異性是保證親和層析高分辨率的重要因素，但尋找特異性配體一般是比較困難的，尤其對于一些性質(zhì)不很了解的生物大分子，要找到合適的特異性配體通常需要大量的實(shí)驗(yàn)。通用性配體一般是指特異性不是很強(qiáng)，能和某一類的蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)合的配體，如各種凝集素（lectine）可以結(jié)合各種糖蛋白，核酸可以結(jié)合RNA、結(jié)合RNA的蛋白質(zhì)等。通用性配體對生物大分子的專一性雖然
8、不如特異性配體，但通過選擇合適的洗脫條件也可以得到很高的分辨率。而且這些配體還具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、偶聯(lián)率高、吸附容量高、易于洗脫
