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1、第七章親和層析一般用于純化蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)的方法的主要依據(jù)是各種大分子物質(zhì)之間理化特性的差異性。缺點(diǎn)：由于這種差異性較小，因此要得到一種純度稍高的物質(zhì)，常常需要繁瑣的操作，經(jīng)歷較長(zhǎng)的時(shí)間，但最終收得率卻甚低。1967年Axen等用溴化氰活化多糖凝膠偶聯(lián)肽和蛋白質(zhì)的方法，并成功地制備了固定化酶。這種利用大分子物質(zhì)具有的特異的生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行純化的方法，于20世紀(jì)70年代就有了驚人的發(fā)展，并逐步得到了廣泛的應(yīng)用。這使酶類等大分子物質(zhì)的純化過(guò)程變得較簡(jiǎn)單、迅速和高效(見表7-1)。第一節(jié)基本原理M
2、-L-S復(fù)合物欲分離的大分子物質(zhì)S與相對(duì)應(yīng)的專一物質(zhì)L(配體)以次級(jí)鍵結(jié)合（親和力），能生成一種可解離的絡(luò)合物L(fēng)-S，其中的L又能與活化的基質(zhì)M以共價(jià)鍵首先結(jié)合，而形成M-L-S復(fù)合物。親和吸附劑配體L以共價(jià)鍵的方式固化到含有活化基團(tuán)的基質(zhì)M上，制成親和吸附劑M-L，或者叫做固相載體。親和層析法根據(jù)L-S之間能可逆地結(jié)合與解離的原理發(fā)展起來(lái)的層析方法，稱為親和層析法(affinitychromatography)。親和層析的原理(見圖7-1)：每對(duì)反應(yīng)物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應(yīng)中
3、，特異的底物(S’)才能和一定的酶(E)結(jié)合，產(chǎn)生復(fù)合物(E-S’)一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，并產(chǎn)生復(fù)合物。層析分離過(guò)程：樣品過(guò)柱時(shí)，樣品中對(duì)配體有親和力的物質(zhì)S就可借助靜電引力、范德瓦爾力，以及結(jié)構(gòu)互補(bǔ)效應(yīng)等作用吸附到固相載體上;無(wú)親和力或非特異吸附的物質(zhì)則被起始緩沖液洗滌出來(lái)，并形成了第一個(gè)層析峰；然后，恰當(dāng)?shù)馗淖兤鹗季彌_液的pH值、或增加離子強(qiáng)度、或加入抑制劑等因子，即可把物質(zhì)S從固相載體上解離下來(lái)，并形成了第二個(gè)層析峰(見圖7-2B)。如果樣品液中
4、存在兩個(gè)以上的物質(zhì)與固相載體具有親和力(其大小有差異)時(shí)，則采用選擇性緩沖液進(jìn)行洗脫，也可以將它們分離開。使用過(guò)的固相載體經(jīng)再生處理后，可以重復(fù)使用。上面介紹的親和層析法亦稱：特異性配體親和層析法配體,一般為復(fù)雜的生命大分子物質(zhì)(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強(qiáng)的吸附選擇性和較大的結(jié)合力；另有一種親和層析法叫：通用性配體親和層析法配體,則一般為簡(jiǎn)單的小分子物質(zhì)(如金屬、染料、以及氨基酸等)，它成本低廉，具有較高的吸附容量，通過(guò)改善吸附和脫附條件可提高層析的分辨率。特點(diǎn)：親和層析的分辨率比
5、凝膠過(guò)濾層析高。用親和層析法純化樣品時(shí)，操作步驟少，活力不易喪失。該法的缺點(diǎn)是：要分離一種物質(zhì)必須找到適宜的配體，并將其制成固相載體之后方可進(jìn)行。第二節(jié)操作一、基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)滿足下面的要求：1．極低的非特異吸附性；2．高度的親水性。親和吸附劑要易與水溶液中的生命大分子物質(zhì)接近。3．較好的理化穩(wěn)定性。當(dāng)配體固化和各種因素(如pH、離子強(qiáng)度、溫度和變性劑等)變化時(shí)，基質(zhì)很少甚至不受影響；4．大量的化學(xué)基團(tuán)能被有效地活化，而且容易和配體結(jié)合；5．適當(dāng)?shù)亩嗫仔?即孔徑大小和篩孔多少)。具體要求須根
6、據(jù)分離物的性質(zhì)而定：當(dāng)分離物與配體親和力弱時(shí)，選用多孔性好的基質(zhì)可提高結(jié)合容量；當(dāng)分離物呈顆粒狀或碎片狀時(shí)，則選用多孔性差的基質(zhì)對(duì)改善分離效果有利。一般親和吸附劑采用的基質(zhì)有：纖維素、聚丙烯酰胺凝膠、交聯(lián)葡聚糖、瓊脂糖、交聯(lián)瓊脂糖以及多孔玻璃珠。相比之下，實(shí)踐中應(yīng)用較多的基質(zhì)是：聚丙烯酰胺凝膠(Bio-300)、多孔性玻璃珠、瓊脂糖珠(Sepharose4B)。三種基質(zhì)中，目前應(yīng)用最多的是：Sepharose4BSepharose由D-半乳糖和3，6-脫水-L-半乳糖結(jié)合成的鏈狀多糖；它基本上能符
7、合理想基質(zhì)的五點(diǎn)要求；同時(shí)Sepharose極易用溴化氰活化，并易于引入不同的基團(tuán)；在溫和的條件下，可以連接較多的配體，容易吸附大分子物質(zhì)，且吸附容量也較大；此外，Sepharose4B的結(jié)構(gòu)比Sepharose6B疏松，機(jī)械強(qiáng)度比Sepharose2B好。因此，Sepharose4B成了親和層析中廣泛使用的一種基質(zhì)。二、配體的選擇可選擇的配體有：抑制劑、效應(yīng)物、酶的輔助因子、類似底物、抗體[包括半抗原(堿基、核苷、核苷酸、寡核苷酸)-蛋白質(zhì)復(fù)合物抗體]、其他物質(zhì)(如外源凝集素、polyA、pol
8、yU、染料和金屬離子)等。優(yōu)良的配體須具備兩個(gè)條件：1）與純化的物質(zhì)有較強(qiáng)親和力一般來(lái)說(shuō)，配體對(duì)大分子物質(zhì)的親和力越高(即Ki（抑制常數(shù)）或Ka（解離常數(shù)）較小)，在親和層析中應(yīng)用的價(jià)值就越大。2）具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)該基團(tuán)和基質(zhì)結(jié)合后，對(duì)配體與互補(bǔ)蛋白的親和力沒有影響或影響不明顯。就目前所知，可用作配體的種類很多，表7-2。三、親和吸附劑的制備把配體偶聯(lián)到基質(zhì)上的方法有兩類：物理的（如包埋法和吸附法等）化學(xué)的（如偶聯(lián)法和交聯(lián)法等）交聯(lián)法：是用雙功能試劑(如戊二醛、碳化二亞胺等
