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1、酵母雙雜交轉(zhuǎn)錄激活因子DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(BD)(DNAbindingdomain)轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域(AD)(activationdomain)這兩個結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響,單獨存在時都沒有轉(zhuǎn)錄激活的功能，只有二者在空間上充分接近時，才表現(xiàn)出一個完整的激活特定基因表達的激活因子的功能。二、酵母雙雜交系統(tǒng)的建立Gal4為酵母半乳糖苷酶基因gal1的轉(zhuǎn)錄激活因子，天然的Gal4分子是由一條由881個氨基酸殘基組成的多肽鏈。兩個結(jié)構(gòu)域中的DNA-BD由位于N-末端的1～147位多肽構(gòu)成，能識別位于Gal4基因的上游激活序列(upstreama
2、ctivationsequence，UAS)。AD由位于C-末端的768～881位多肽構(gòu)成。當Gal4的兩個結(jié)構(gòu)域位于不同肽鏈上，只要它們在空間上充分接近，則能恢復Gal4作為轉(zhuǎn)錄因子的活性。酵母Gal4的結(jié)構(gòu)1147768881DBD（DNA-bindingdomain）(AD)ActivationDomainDBD（DNA-bindingdomain）：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域AD（activationdomain）：轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域Fields和Song將兩個融合蛋白分別構(gòu)建在穿梭質(zhì)粒上，一個是將Gal4的DNA-BD與酵母蛋白SNF1融
3、合；另一個是將Gal4的AD和酵母蛋白SNF4融合。其中，SNF1是一種絲氨酸/蘇氨酸的蛋白激酶，SNF4是它的一個結(jié)合蛋白，這兩種蛋白是已知可以相互作用的。當兩種穿梭質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化含有Gal4結(jié)合位點的報告基因LacZ的酵母菌株后，通過SNFl與SNF4的相互作用，Gal4的DNA-BD與Gal4的AD靠近,形成一個大的復合物Gal4BD-SNF1-SNF4-Gal4-AD。Gal4的DNA-BD可識別位于Gal4效應(yīng)基因的UAS，并可與之結(jié)合；Gal4的AD則可與轉(zhuǎn)錄復合物中其他成分結(jié)合，激活UAS下游報告基因LacZ的轉(zhuǎn)錄。酵母轉(zhuǎn)錄
4、因子（Gal4）與BD-fusion---誘餌蛋白（baitprotein）與AD-fusion---獵物或靶蛋白（preyortargetprotein）報告基因（reportergene）---LacZ（編碼β-半乳糖苷酶）酵母細胞作為報道株的酵母雙雜交系統(tǒng)具有許多優(yōu)點:易于轉(zhuǎn)化、便于回收擴增質(zhì)粒具有可直接進行選擇的標記基因和特征性報告基因酵母的內(nèi)源性蛋白不易同來源于哺乳動物的蛋白相互結(jié)合報道株經(jīng)改造的、含報告基因的重組質(zhì)粒的宿主細胞。三、酵母雙雜交系統(tǒng)的原理可通過檢測報告基因的轉(zhuǎn)錄與否來研究蛋白質(zhì)X和Y的相互作用。酵母Gal4基
5、因轉(zhuǎn)錄表達Gal4分子的DNA結(jié)合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結(jié)合，而轉(zhuǎn)錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉(zhuǎn)錄。釣餌蛋白目的蛋白（靶蛋白）假設(shè)將X、Y蛋白分別與轉(zhuǎn)錄因子的DBD和AD融合產(chǎn)生新的融合蛋白。酵母雙雜交載體及菌株共轉(zhuǎn)化至酵母菌株如果這兩個蛋白能夠互相作用，則該相互作用會促使DBD和AD互相靠近而產(chǎn)生有活性的轉(zhuǎn)錄因子，進而激活事先構(gòu)建到酵母基因組中的報告基因的轉(zhuǎn)錄。酵母雙雜交系統(tǒng)的報告基因通常由一些營養(yǎng)選擇標記（如HIS3基因的轉(zhuǎn)錄激活能使酵母在缺乏組氨酸的培養(yǎng)基上生
6、長）或編碼酶的基因（MEL1基因的轉(zhuǎn)錄激活能使酵母產(chǎn)生a-半乳糖苷酶）組成。檢測LacZ活性陽性克隆可誘導產(chǎn)生高水平的?-半乳糖苷酶。該酶在X-gal存在的情況下現(xiàn)色反應(yīng)呈藍色。篩選四、酵母雙雜交系統(tǒng)的優(yōu)點高敏感性。檢測的結(jié)果是基因表達產(chǎn)物的累積效應(yīng)，可檢測存在于蛋白質(zhì)間的微弱或暫時的相互作用。真實性。檢測在活細胞內(nèi)進行，作用條件與作用力無需模擬，在一定程度上代表細胞內(nèi)的真實情況。簡捷性。融合蛋白相互作用后，減少了制備抗體和純化蛋白質(zhì)等的繁瑣步驟。廣泛性。采用不同組織器官細胞類型和分化時期的材料構(gòu)建cDNA文庫，能分析不同亞細胞部位和
7、功能的蛋白質(zhì)，適用于部分細胞質(zhì)、細胞核及膜結(jié)合蛋白。五、酵母雙雜交的應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)是在真核模式生物酵母中進行的，研究活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)相互作用，對蛋白質(zhì)之間微弱的、瞬間的作用也能夠通過報告基因的表達產(chǎn)物敏感地檢測得到，它是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)。大量的研究文獻表明，酵母雙雜交技術(shù)既可以用來研究哺乳動物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作，也可以用來研究高等植物基因組編碼的蛋白質(zhì)之間的互作。因此，它在許多的研究領(lǐng)域中有著廣泛的應(yīng)用。1、發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)的新功能酵母雙雜交技術(shù)已成為發(fā)現(xiàn)新基因的主要途徑。用已知基因作誘餌
8、，利用酵母雙雜交系統(tǒng)在選定的cDNA文庫中篩選與其相互作用的新蛋白，再從酵母中分離得到AD-Library載體，對其進行測序并在GenBank中進行比較，可以得到與已知基因在生物學功能上的聯(lián)系。另外，也可作為研究已知基因
