恩拉霉素含量測定方法改進(jìn)

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1、恩拉霉素含量測定方法改進(jìn)　　摘要：針對《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》1999年版收錄的恩拉霉素預(yù)混劑含量測定方法中部分檢測條件進(jìn)行了適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)，將pH4.0醋酸鹽緩沖液改為pH7.8的磷酸鹽緩沖液，檢驗用菌株改為金黃色葡萄球菌，培養(yǎng)基改為Ⅱ號pH7.8的培養(yǎng)基，終濃度由10～40U/mL改為100～400U/mL，由振搖30min改為超聲提取90min。優(yōu)化了檢驗條件，使檢驗結(jié)果更精準(zhǔn)可靠。關(guān)鍵詞：恩拉霉素；效價測定；微生物檢定法中圖分類號：S859.79+6文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B文章編號：1007-273X（2013）06-0015-02恩拉霉素（Enramycin）是

2、由放線菌（Streptomycesfungicidicus）發(fā)酵而得，其包括13個不同種類的17個氨基酸分子和脂肪酸分子所組成的有機(jī)堿。其中氨基酸分子構(gòu)成環(huán)狀多肽結(jié)構(gòu)，脂肪酸位于多肽結(jié)構(gòu)末端，據(jù)其末端脂肪酸種類不同，分為恩拉霉素6A（C107H138Cl2N26O31）和恩拉霉素B（C108H140Cl2N26O31）。恩拉霉素對革蘭氏陽性菌有很強(qiáng)的抑制作用，如梭狀芽孢桿菌、鏈球菌、葡萄球菌、肺炎雙球菌等革蘭氏陽性菌均具有很強(qiáng)的抑制作用。尤其是對梭狀芽孢桿菌（Clostridium）作用更加顯著。恩拉霉素不同于其他抗生素的是長期使用后不容易產(chǎn)生耐藥性，并

3、能促進(jìn)豬、雞增重和提高飼料轉(zhuǎn)化率。目前國內(nèi)獸藥恩拉霉素含量測定方法的依據(jù)為中國農(nóng)業(yè)部發(fā)布的1999年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》。依據(jù)恩拉霉素的藥理學(xué)特點(diǎn)，在實際檢測工作中對樣品提取、緩沖液及終濃度等檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，建立新的檢測方法，使得檢測條件更合理，結(jié)果更精準(zhǔn)。1材料與方法1.1試驗材料（1）試劑及培養(yǎng)基。冰醋酸、醋酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、丙酮、鹽酸等試劑均為分析純。試驗用水為蒸餾水。pH4.0醋酸鹽緩沖液按照1999年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》提供方法配制[1]，pH7.8的磷酸鹽緩沖液按照2010版的《中國獸藥典》一部附錄抗生素微生物檢定法配制[2

4、]?？股貦z定培養(yǎng)基Ⅰ號pH7.8、Ⅱ號pH7.8均購于北京海淀中海動物保健科技公司。（2）菌種及標(biāo)準(zhǔn)品?？莶菅挎邨U菌[CMCC（B）63501]，金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]來源于中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。標(biāo)準(zhǔn)品由武漢興鼎生物科技公司提供，標(biāo)示效價為1216U/mg。（3）樣品4%的恩拉霉素預(yù)混劑由興鼎生物科技公司提供。（4）儀器設(shè)備。TOMY6ES310高壓滅菌器，干燥箱，恒溫水浴培養(yǎng)箱，ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀，移液槍（最大量程1000μL）。1.2試驗方法（1）按文獻(xiàn)[2]分別制備pH7.8培養(yǎng)基Ⅰ鋪加枯草芽孢桿菌[CM

5、CC（B）63501]菌懸液和pH7.8培養(yǎng)基Ⅱ鋪加金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26003]菌懸液的雙碟備用。（2）精密稱取標(biāo)準(zhǔn)品適量，按文獻(xiàn)[1]加提取液（丙酮：1mol/l鹽酸：水=35：12：56），制成含1000U/mL的備用液，再分別用pH4.0的緩沖液與pH7.8的磷酸緩沖液制成濃度分別為10、40U/mL與100、400U/mL的兩組高低劑量溶液備用。取制備好的1.2（1）中兩種雙碟，分別滴加這兩組高低劑量的溶液，同時滴加上述兩種緩沖液做空白對照，（37±1）℃培養(yǎng)。（3）按文獻(xiàn)[1]取本品適量，精密稱定樣品2.5000g，加提取液（丙酮

6、：1mol/l鹽酸：水=35：12：56），制成含恩拉霉素1000U/mL的溶液，充分振搖30min，取上清液，用醋酸鹽緩沖液（pH4.0）稀釋成終濃度分別為10U/mL和40U/mL的溶液；按文獻(xiàn)[2]測定3批樣品的含量。（4）精密稱定樣品2.5000g，加提取液（丙酮：1mol/l鹽酸：水=35：12：56）約80mL，水浴超聲40min，冷至室溫，加提取液制成含恩拉霉素1000U/mL的溶液，用磷酸鹽緩沖液（pH7.8）稀釋成終濃度分別為10、40U/6mL與100、400U/mL的兩組溶液；菌懸液菌株為金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003〕，

7、培養(yǎng)基為Ⅱ號pH7.8，其他檢測條件不變，按文獻(xiàn)[2]方法測定3批樣品的含量。（5）在1.2（4）基礎(chǔ)上將樣品超聲提取時間分別設(shè)定為10、20、40、60、90min，終濃度為100和400U/mL的溶液，其他檢測條件不變，按文獻(xiàn)[2]方法測定3批樣品的含量。2結(jié)果與分析（1）按文獻(xiàn)[1]所載方法，在pH7.8培養(yǎng)基Ⅰ鋪加枯草芽孢桿菌菌懸液的雙碟上滴加醋酸鹽緩沖液（pH4.0）做為試驗空白對照，培養(yǎng)結(jié)果產(chǎn)生明顯的抑菌圈。滴加的標(biāo)準(zhǔn)溶液高、低濃度形成的抑菌圈平均差值小于1，劑間差異不明顯。按改進(jìn)方法的pH7.8培養(yǎng)基Ⅱ鋪加金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26

8、003]菌懸液的雙碟上滴加pH7.8的磷酸緩沖液為空白的雙碟，培養(yǎng)結(jié)果無抑菌圈。