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1、大鼠肝卵圓細(xì)胞細(xì)胞間黏附分子論文【摘要目的摘要:探索細(xì)胞間黏附分子1(ICAM1)在肝卵圓細(xì)胞(HOCs)中的表達(dá),及核因子(NFκB)對(duì)其表達(dá)的調(diào)控功能.方法摘要:0.6g/kg3′甲基4二甲基胺偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）飼喂Wistar大鼠4wk,制作肝損傷模型.利用Percoll密度梯度離心法分離HOCs,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)HOCs對(duì)ICAM1的表達(dá)；體外培養(yǎng)HOCs并分別用NFκB激動(dòng)劑TNFα和NFκB抑制劑TGFβ1干預(yù),RTPCR對(duì)ICAM1mRNA進(jìn)行半定量分
2、析,比較在TNFα和TGFβ1的調(diào)控下ICAM1mRNA表達(dá)的變化.結(jié)果摘要:HOCsICAM1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)明顯陽性.和對(duì)照組比較,體外培養(yǎng)HOCs時(shí)TNFα促進(jìn)HOCs的增殖(P%26lt;0.01),TGFβ1對(duì)HOCs的增殖能力無明顯影響；RTPCR半定量分析,和對(duì)照組比較，TNFα組ICAM1mRNA相對(duì)灰度值增高(P%26lt;0.01),而TGFβ1組ICAM1mRNA相對(duì)灰度值降低(P%26lt;0.01).結(jié)論摘要:在肝損傷組織中HOCs表達(dá)ICAM1,TNFα和TGFβ1分別通過對(duì)NFκB活性的促進(jìn)和抑制
3、來調(diào)控ICAM1的表達(dá).【細(xì)胞間黏附分子1;肝卵圓細(xì)胞；核因子κB0引言近年來,肝卵圓細(xì)胞（hepaticstemcells,HOCs）的探究受到重視［1］.在大鼠肝損傷和肝癌模型的肝組織中存在HOCs大量增生［2］,但哪種細(xì)胞表達(dá)ICAM1還不完全清楚.骨髓造血干細(xì)胞（hemopoieticstemcells,HSCs）表面存在一組以ICAM1為主的黏附分子,能介導(dǎo)HSCs和骨髓基質(zhì)的黏附,從而使HSCs產(chǎn)生一種定向遷移的功能［3］.探究表明,HOCs可以來自于HSCs.既然HOCs可以來自于HSCs,且HSCs表達(dá)ICAM
4、1,那么HOCs也應(yīng)象HSCs一樣能表達(dá)ICAM1.為此,我們探究HOCs表達(dá)ICAM1的證據(jù)及其調(diào)控.1材料和方法1.1材料5學(xué)海無涯Wistar大鼠6只,雌雄不限,體質(zhì)量(110±10)g,由南方醫(yī)科大學(xué)(原第一軍醫(yī)大學(xué))實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.3′甲基4二甲胺基偶氮苯（3′methyldimethylaminoazobenzene,DAB）購于日本東京化成株式會(huì)社；Percoll分離液購自Pharmacia公司；兔抗鼠ICAM1，即用型SABC試劑盒及DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司；引物由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合
5、成,βantinsenseprimer5′GCATTGTAACCAACTGGGACG3′,antisenseprimer5′TTGCCGATAGTGATGACCT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為535bp；ICAM1senseprimer,5′CGTGCTGTATGGTCCTCG3′,antisenseprimer5′GGGCTTGTCCCTTGAGTT3′,擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度422bp；Marker購于上海生工生物工程公司；總RNA提取試劑盒、mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶、Taq聚合酶購于Promega公司；Ⅳ型膠原酶、TNFα,TGFβ1購于Sigma
6、公司.1.2方法Wistar大鼠正常飼喂1wk后,給予含0.6g/kgDAB飼料飼養(yǎng),正常飲水,于4wk后大鼠1只,戊巴比妥鈉麻醉(25mg/kg,ip),開腹,門靜脈切開插管,25mL/min灌注DHanks液至肝表面淡黃除去肝組織里的血液,灌注0.6g/LⅣ型膠原酶至肝組織黃色糜狀,將整塊肝組織移入燒杯搗碎,于震蕩箱37℃恒溫震蕩消化40min,經(jīng)100目篩網(wǎng)過濾,未過濾的組織塊繼續(xù)搗碎,加入0.6g/LⅣ型膠原酶繼續(xù)震蕩消化40min,收集過濾液分裝于離心管中4℃100g離心10min,取上清液分裝于離心管4℃1000g
7、離心30min,棄上清液,用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞懸液.高速離心管分裝Percoll梯度離心液,細(xì)胞液鋪于上層,4℃12000g離心30min,吸取700mL/L和500mL/L之間細(xì)胞液,DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋,4℃1000g離心30min,棄上清液,用150mL/L胎牛血清稀釋細(xì)胞密度至1.0×109/L.取4個(gè)12孔培養(yǎng)板分別標(biāo)記為A，B，C，D4組,每組又分為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ亞組,每亞組4孔,各孔加入上述細(xì)胞懸液0.5mL,然后加適量細(xì)胞培養(yǎng)基,Ⅰ亞組為空白對(duì)照組,Ⅱ亞組和Ⅲ亞組分別加入2.0×105U/L的TNFα和1
8、0mg/L的TGFβ1.分別于3，6，9，12d計(jì)數(shù)A，B，C，D組中各1組的細(xì)胞數(shù).1.2.1ICAM1免疫細(xì)胞化學(xué)上述細(xì)胞液適量滴于防脫片處理的清潔載玻片上,培養(yǎng)8h后細(xì)胞黏附貼壁.具體操作按SABC法試劑盒說明進(jìn)行.光鏡下觀察結(jié)果.5學(xué)海無涯1.2.2ICAM1的RTP
