一株高效褐藻膠降解菌的篩選及其性質(zhì)的初步研究

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1、一株高效褐藻膠降解菌的篩選及其性質(zhì)的初步研究王麗娟展長(zhǎng)淑孫彥粉王振杰(山東大學(xué)威海分校海洋學(xué)院,山東威海264209)摘要:從威海近海天然腐爛的海帶中分離得到10株褐藻膠降解菌。以海藻酸鈉為唯一碳源,通過(guò)馴化培養(yǎng)、初篩、復(fù)篩得到一株優(yōu)勢(shì)菌。本課題對(duì)該優(yōu)勢(shì)菌的最適生長(zhǎng)條件及最適產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究,并對(duì)其酶的性質(zhì)做了初步研究。關(guān)鍵詞:褐藻膠降解菌;篩選;最適生長(zhǎng)條件:最適產(chǎn)酶條件:降解酶性質(zhì)Abstract:10algindegradingbacteriawereisolatedfromnaturaldecayingkelpofWeihaioffshor

2、e.Adominantbacteriahasgotthroughdomestication,screening,andrescreenedusingAlginateasasolesourceofcarbon.Intheissuewestudiedaboutthedominantbacteria,soptimalgrowthconditionsandtheconditionsforenzymeproduction,andalsoapreliminarystudyahoutthenatureofitsactivity.Keywords:Algindeg

3、radingbacteria;Screening;Theoptimumgrowthconditions;enzymeproductionconditions;Enzymenature褐藻膠(algin)是褐藻細(xì)胞壁的填充物質(zhì),是一種由α-D-甘露糖醛酸和β-L-古羅糖醛酸兩種單糖組成的線形多糖[1]。褐藻膠應(yīng)用廣泛,但其相對(duì)分子質(zhì)量較大,導(dǎo)致其溶解度較低,溶液粘性較大,應(yīng)用受到很大限制。近年來(lái),褐藻膠寡糖生物活性的研究取得了重大進(jìn)展,如調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)、誘導(dǎo)植物抗病能力、抗腫瘤及抗老年癡呆,以及防治海洋無(wú)脊椎動(dòng)物常見(jiàn)病的功能等[2]。因而通過(guò)各種降解方

4、法制備的褐藻膠寡糖在糖化學(xué)、糖生物學(xué)、糖工程及糖類(lèi)藥物研究領(lǐng)域具重要的研究?jī)r(jià)值。目前褐藻膠寡糖的獲取方法主要有物理降解法、酸降解法,氧化降解法和酶解法等。其中酶解法是一種條件溫和、可控性強(qiáng)和特異性高的生物降解方法,是目前的主要研究方向[3]。因此褐藻膠降解酶具有重要的開(kāi)發(fā)價(jià)值和研究意義。本項(xiàng)目的研究重點(diǎn)在于利用微生物得到降解酶并最終獲得寡糖,通過(guò)誘導(dǎo)篩選出產(chǎn)酶量高、酶活性強(qiáng)的優(yōu)勢(shì)菌株,確定出其最適生長(zhǎng)條件和最適產(chǎn)酶條件,并對(duì)降解酶的性質(zhì)做出初步研究。1.材料與方法1.1材料1.1.1樣品采集腐爛海帶采集于山東省威海市近海1.1.2培養(yǎng)基成分初篩培養(yǎng)

5、基(g/L):海藻酸鈉10;硝酸鉀1.0;氯化鈉15;磷酸氫二鉀0.5;硫酸鎂0.5;硫酸亞鐵0.01;瓊脂15-20;水1000mL馴化培養(yǎng)基(g/L):褐藻酸鈉;氯化鈉15;蛋白胨1.0;磷酸氫二鉀1.0;磷酸二氫鉀1.0;磷酸氫二鈉1.0;硫酸鎂0.5;硫酸亞鐵0.01;水1000mL復(fù)篩及發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):褐藻酸鈉10;硫酸銨5.0;磷酸氫鉀2.0;氯化鈉l5;硫酸鎂1.0;硫酸亞鐵0.01;酵母膏1.0;水1000mL保藏培養(yǎng)基(g/L):牛肉膏5.0;蛋白胨10;磷酸氫二鈉2;氯化鈉5;瓊脂5-7;水1000ml;PH7.4-7.6

6、1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1菌株的馴化用海水浸泡天然腐爛海帶,制備菌懸液,取1ml菌懸液移入到30ml含海藻酸鈉2g/L的馴化培養(yǎng)基中,同時(shí)觀察培養(yǎng)液的變化,3天后,取1ml馴化液至新鮮馴化培養(yǎng)基中,海藻酸鈉濃度按4、6、8、10g/L逐步提高,共馴化5代。1.2.2菌種的分離取第5代培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋后涂布于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上。30。C培養(yǎng)72小時(shí)。待菌落長(zhǎng)好,挑取不同形態(tài)特征的菌落,劃線分離直至得到純化的單菌落。1.2.3菌種的初篩將分離得到的單菌落接于初篩平板上,置30。C培養(yǎng)72小時(shí)后,選取在平板上生長(zhǎng)的菌株,接種到斜面4。C冰箱保藏備用。1

7、.2.4菌種的復(fù)篩1.2.4.1制備液體菌株將30ml發(fā)酵培養(yǎng)基裝入100ml三角燒瓶中,于121.5。C滅菌。挑取一環(huán)新鮮的初篩菌株斜面種子,于28。C搖瓶培養(yǎng)48小時(shí)。1.2.4.2在100ml三角燒瓶中裝入發(fā)酵培養(yǎng)基50ml按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入液體菌種,28。C搖瓶培養(yǎng)72小時(shí)后測(cè)定發(fā)酵培養(yǎng)基中生物量,并用3,5-二硝基水楊酸法酶活。對(duì)菌體用細(xì)胞破碎儀進(jìn)行破壁后再測(cè)酶活。1.2.4.3寡糖含量與生物量的測(cè)定生物量的測(cè)定:用721型分光光度計(jì)為620nm處測(cè)定發(fā)酵液的吸光度值,以空白發(fā)酵培養(yǎng)基作對(duì)照。寡糖含量的測(cè)定:本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法

8、測(cè)定寡糖含量。第一,可用3,5-二硝基水楊酸法測(cè)定酶解產(chǎn)物中還原糖的含量。反應(yīng)體系溶液包括,1.0ml1%海藻酸鈉溶液,4

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