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《國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞的發(fā)展、標(biāo)記及示蹤技術(shù)總結(jié)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞的發(fā)展、標(biāo)記及示蹤技術(shù)總結(jié) 近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)方法只能使許多器官損傷疾病減輕其并發(fā)癥，不能從根本上解決疾病的根本問(wèn)題，患者的健康水平和生活質(zhì)量、精神狀態(tài)都遭受?chē)?yán)重的威脅。醫(yī)學(xué)的進(jìn)步需要研究新的臨床治療手段，干細(xì)胞應(yīng)用于疾病的治療研究，為臨床事業(yè)帶來(lái)良好的應(yīng)用前景，并且得到了越來(lái)越多研究的證實(shí)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床試驗(yàn)已取得令人鼓舞的研究成果。但是，干細(xì)胞在疾病治療用途中真正起作用的機(jī)制至今不明，干細(xì)胞的標(biāo)記方法及示蹤技術(shù)沒(méi)有明顯的突破性是其原因之一，為了更好地了解干細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)的遷徙途徑，本文對(duì)國(guó)內(nèi)外干細(xì)胞的發(fā)展、標(biāo)記及示蹤技術(shù)進(jìn)行了回顧和總結(jié)，為
2、干細(xì)胞的基礎(chǔ)研究及作用機(jī)制的揭示起一定的支撐作用?！ ?干細(xì)胞的標(biāo)記及示蹤技術(shù) 1.1基因轉(zhuǎn)染標(biāo)記法 在干細(xì)胞上標(biāo)記轉(zhuǎn)染基因，檢測(cè)干細(xì)胞移植后的生物學(xué)特性。綠色熒光蛋白（greenfluorescentprotein,GFP）標(biāo)記干細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)中尤為常見(jiàn)。GFP不需要與其他物質(zhì)合作，只需要用藍(lán)光照射，就能自我發(fā)光。GFP的熒光穩(wěn)定，易于構(gòu)建載體、可進(jìn)行活細(xì)胞定時(shí)定位觀(guān)察、在許多動(dòng)植物中都能夠表達(dá)成功并發(fā)出熒光，可用顯微鏡呈像技術(shù)方便地在活細(xì)胞中檢測(cè)，適用與其他熒光試劑同時(shí)進(jìn)行雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)?！ FP對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記最明顯的優(yōu)勢(shì)是無(wú)需底物或輔因子參與，即可在活細(xì)胞或動(dòng)物中進(jìn)行有
3、效地標(biāo)記，GFP已成功地靶入了大部分細(xì)胞器中[1].目前，GFP的具體半衰期還未知，不利于在實(shí)驗(yàn)中對(duì)時(shí)間的掌控，并且一些物理因素如高溫等；化學(xué)因素有強(qiáng)酸等可以破壞它水化層或雙電層，對(duì)其進(jìn)行降解?！ ?.2熒光染料標(biāo)記法 干細(xì)胞移植前，使用熒光素進(jìn)行預(yù)先標(biāo)記，移植后利用熒光顯微鏡觀(guān)察熒光標(biāo)記的干細(xì)胞的遷徙情況，目前以Dil的衍生物CM-Dil的標(biāo)記更為高效。CM-Dil通過(guò)與膜結(jié)構(gòu)的脂質(zhì)分子結(jié)合而標(biāo)記細(xì)胞，有著強(qiáng)而穩(wěn)定的紅色熒光，它容易嵌進(jìn)生物質(zhì)膜內(nèi)并在膜內(nèi)做定向擴(kuò)散運(yùn)動(dòng)從而標(biāo)記整個(gè)細(xì)胞，是目前最好的熒光染料[2].CM-Dil標(biāo)記細(xì)胞后再進(jìn)行各種操作都不會(huì)影響其熒光，是免
4、疫熒光組化和原位雜交中理想的細(xì)胞熒光標(biāo)記染料。CM-Dil標(biāo)記后熒光在胞內(nèi)表達(dá)穩(wěn)定，陽(yáng)性標(biāo)記率高，標(biāo)記細(xì)胞形態(tài)良好，能有效地觀(guān)察細(xì)胞在體外的誘導(dǎo)分化情況[3].但是，CM-Dil是通過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行標(biāo)記，隨著細(xì)胞的分裂增殖造成熒光的指數(shù)級(jí)衰減，使其很難維持長(zhǎng)時(shí)間的高標(biāo)記率?！ ?.3熒光原位雜交標(biāo)記法 熒光原位雜交（fluorescenceinsituhybridiza-tion,FISH）方法，即制備DNA或RNA探針，通過(guò)原位雜交的方法，使特定的DNA或RNA序列在細(xì)胞或染色體上顯示出來(lái)，使用熒光顯微鏡檢測(cè)，最后對(duì)其結(jié)果進(jìn)行分析。FISH技術(shù)[4]使用經(jīng)濟(jì)、增強(qiáng)了安全性，
5、簡(jiǎn)化操作流程、效率高和定位準(zhǔn)確。多色FISH通過(guò)在同一個(gè)核中顯示不同的顏色可同時(shí)檢測(cè)多種序列，既可以在載玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。熒光原位雜交技術(shù)對(duì)即時(shí)發(fā)現(xiàn)腫瘤和預(yù)后都有良好的指導(dǎo)作用。但是，該方法不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。 1.4核酸標(biāo)記法 5-溴脫氧尿嘧啶核苷（Brdu）是一種嘧啶類(lèi)似物，與內(nèi)源性胸腺嘧啶核苷競(jìng)爭(zhēng)插入DNA中，經(jīng)過(guò)免疫組化染色，跟隨標(biāo)記細(xì)胞增殖傳代，反映細(xì)胞增殖并且跟蹤檢測(cè)移植細(xì)胞動(dòng)態(tài)變化[5].核素標(biāo)記法避免了放射性污染，安全性高，并且Brdu抗體不與胸
6、腺嘧啶發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)活體動(dòng)物進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，無(wú)任何不良反應(yīng)。在研究干細(xì)胞體內(nèi)移植后的分化時(shí)，更可采用雙標(biāo)法顯示干細(xì)胞的其他特性。但是，Brdu標(biāo)記存在著標(biāo)記率不穩(wěn)定的特點(diǎn)，隨著標(biāo)記時(shí)間的增長(zhǎng)，細(xì)胞的凋亡，吞噬細(xì)胞的吞噬作用，周?chē)?xì)胞也可能會(huì)被Brdu標(biāo)記，移植細(xì)胞標(biāo)記強(qiáng)度降低或丟失，從而很難測(cè)定出真正需要檢測(cè)觀(guān)察的干細(xì)胞?！ ?.5磁共振成像技術(shù) 磁共振（NuclearMagicResonance,NMR）活體示蹤SPIO細(xì)胞已經(jīng)成為新的研究熱點(diǎn)。在體外使用SPIO對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)染劑修飾后進(jìn)一步提高細(xì)胞的有效磁標(biāo)記率，含鐵顆粒即可進(jìn)入移植細(xì)胞內(nèi)，標(biāo)記率可達(dá)到99%
7、[6].在一定的濃度范圍內(nèi)，鐵顆粒對(duì)細(xì)胞的活性沒(méi)有明顯的影響，然后利用磁共振成像對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行追蹤，根據(jù)其位置的改變和信號(hào)的衰減從而判斷干細(xì)胞的增殖、移行和空間分布情況，SPIO納米顆粒標(biāo)記技術(shù)逐漸成熟[7].但是，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，細(xì)胞增生分裂死亡，氧化鐵微粒會(huì)殘留在死亡的組織內(nèi)或者被巨噬細(xì)胞吞噬，會(huì)導(dǎo)致標(biāo)記敏感性下降，造成假陽(yáng)性結(jié)果，同時(shí)，需要考慮氧化鐵造影劑顆粒對(duì)機(jī)體所產(chǎn)生的長(zhǎng)期影響?！ ?.6近紅外熒光成像技術(shù) 半導(dǎo)體量子點(diǎn)（QuantumDots,QDS）為現(xiàn)在廣泛使用的近紅外熒光材料，QDS具有寬而連續(xù)的吸收
