兔抗cap43多克隆抗體制備和初步純化論文

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1、兔抗Cap43多克隆抗體制備和初步純化論文【摘要】目的制備兔抗Cap43多克隆抗體。方法以30個(gè)氨基酸組成的多肽為半抗原與鑰孔血藍(lán)蛋白(mcKLH)通過(guò)碳化二亞胺(EDC)法化學(xué)偶聯(lián)成完全抗原(多肽-mcKLH)免疫家兔；制備兔抗Cap4443多克隆抗體；斑點(diǎn)ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，經(jīng)辛酸-硫酸銨法初步純化抗體后，十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳考馬斯亮藍(lán)檢測(cè)其純化后的純度。結(jié)果經(jīng)免疫11周得到兔抗Cap43多克隆體，抗體效價(jià)為1：500。結(jié)論采用EDC化學(xué)偶聯(lián)半抗原和大分子載體蛋白mcKLH，使其

2、成為同時(shí)具有免疫原性與免疫反應(yīng)性的完全抗原，用其免疫家兔獲得多克隆抗體?！娟P(guān)鍵詞】半抗原流行病學(xué)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，鎳化合物可以致癌，以致肺癌為主。為進(jìn)一步研究Cap43在鎳所特異引起肺癌者體內(nèi)組織及血清中的表達(dá)水平及其特點(diǎn).freela公司)；HRP-羊抗兔和DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)公司)；硝纖維素膜(NC膜)，SephadexTMG-25脫鹽柱(AmershamBiosciences,Sg，合成后期經(jīng)HPLC純化，純度95%。冷凍干燥4℃保存。122免疫大耳白兔制備抗Cap43抗血清(1)正式實(shí)驗(yàn)之前的動(dòng)物準(zhǔn)備：取5

3、只體重1.5kg的雄性家兔作為免疫動(dòng)物，同時(shí)抽取免疫前的動(dòng)物血清作為陰性對(duì)照。(2)用EDC法將半抗原與載體蛋白(mcKLH)連接成同時(shí)具有免疫原性與免疫反應(yīng)性的大分子量完全抗原，反應(yīng)過(guò)程嚴(yán)格按照EDC試劑盒的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。(3)使用脫鹽柱脫鹽，純化大分子載體蛋白-多肽連接物：分別用10個(gè)15ml的EP管依次收集10管流出液，紫外分光檢測(cè)波長(zhǎng)280nm處各管的吸光度(A)值，如果在280nm波長(zhǎng)處有1個(gè)顯著的吸收峰，表示連接成功。(4)將連接好的半抗原-載體蛋白混合物與等體積佐劑的混合，采用常規(guī)微量多次免疫法免疫家兔(抗原0.

4、5mg/只)，第1次免疫使用完全福式佐劑，并于4周后進(jìn)行第2次免疫(第2次及以后使用不完全福氏佐劑)，以后每2周免疫1次，于第5次免疫后1周采耳緣靜脈血，間接斑點(diǎn)ELISA法檢測(cè)抗體的效價(jià)，達(dá)到一定效價(jià)后直視下心臟采血收集血清。123斑點(diǎn)ELISA法檢測(cè)抗Cap43多克隆抗體效價(jià)取硝酸纖維素膜(NC膜)制成4cm×4cm的方格，浸入01mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中10min，室溫干燥后，將卵清蛋白(OVA)-半抗原(連接方法與上述半抗原-mcKLH相同)PBS液每格1μl包被NC膜，室溫靜置1h；2%

5、的牛血清白蛋白溶液封閉，室溫振蕩1h；0.5%Tol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)，每格1μl,室溫靜置1h后用洗滌液洗3次，室溫干燥；加酶標(biāo)二抗每格1μl,室溫靜置0.5h后用洗滌液洗3次，5min/次，室溫干燥；每格加入適量底物DAB顯色液，避光顯色5～10min，蒸餾水沖洗中止反應(yīng)，目測(cè)觀察〔1〕。124辛酸-硫酸銨法純化抗體取需純化的血清用60mmol/L，pH4.0醋酸緩沖液稀釋4倍(01mol/L的HCl調(diào)pH4.5)；于室溫?cái)嚢柘略?0min內(nèi)逐滴加入辛酸，按每毫升稀釋前的血清體積加75μl,4℃

6、靜置2h，15000r/min離心30min,棄沉淀；上清濾紙過(guò)濾后加1/10體積的pH7.4，01mol/LPBS(用1mol/L的NaOH調(diào)pH至7.4)；在4℃冰浴下于30min內(nèi)加入0277g/ml硫酸銨，使成45%飽和度，4℃靜置過(guò)夜，12000r/min，離心30min，棄上清；沉淀溶于適量001mol/L、pH7.4的PBS中，用PD10柱過(guò)濾，收集流出液，無(wú)菌過(guò)濾分裝，-20℃保存?zhèn)溆谩?25十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳考馬斯藍(lán)檢測(cè)體抗體純度采用12%SDS-PAGE電泳

7、檢測(cè)抗體純度，將電泳完后的凝膠放于溶解了0.25g考馬斯亮藍(lán)R250的甲醇、水、冰乙酸組成的染色液中室溫過(guò)夜，之后放于脫色液中脫色，直至凝膠底色脫為無(wú)色為止，觀察染色條帶。2結(jié)果21半抗原-載體蛋白連結(jié)后的A值(圖1)從圖1可見(jiàn)，峰值在4，5管，此時(shí)收集第4，5管即峰值所在管中的溶液。圖1半抗原—載體蛋白連接實(shí)驗(yàn)后的A值（略）22斑點(diǎn)ELISA結(jié)果觀察221斑點(diǎn)ELISA實(shí)驗(yàn)條件的選擇(1)最適抗原和酶標(biāo)二抗?jié)舛鹊倪x擇：測(cè)定結(jié)果為抗原為1：20，酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?：320；(2)最適室溫選擇：室溫下1h的效果較4℃過(guò)夜效

8、果要好；(3)最佳封閉條件：采用2%牛血清白蛋白001mol/L的pH7.4的磷酸鹽緩沖液閉效果較好；(4)振蕩對(duì)反應(yīng)的影響：振蕩可加快抗原抗體反應(yīng)速度，與在振蕩條件下封閉0.5h的效果相同；(5)血清滅活：陰性血清經(jīng)滅活56℃滅活補(bǔ)體后假陽(yáng)性反應(yīng)減少。222斑點(diǎn)ELI