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1、6.1血紅蛋白測定（氰化高鐵法） 消光系數(shù)法和標準曲線法任選其一測定血紅蛋白。１.6.1.1光系數(shù)法１.6.1.1.1原理血紅蛋白(haemoglobin，Hb)被鐵氰化鉀氧化后生成高鐵血紅蛋白，再生氰離子結(jié)合形成氰化高鐵血紅蛋白（紅色），氰化高鐵血紅蛋白（紅色）極為穩(wěn)定，在540nm波長下，毫克分子消光系數(shù)為44，據(jù)此，用分光光度法測其光密度，運用消光系數(shù)作血紅蛋白的定量測定。１.6.1.1.2儀器721型或其它型號的分光光度比色計。10微升量吸管。１.6.1.1.3試劑稱取碳酸氫納（）140毫克鐵氰化鉀200毫克、氰化鉀50毫克，用水溶解并稀釋到10
2、00毫升。貯存於棕色試劑瓶內(nèi)，在暗處或冰箱（+4℃）保存，至少可穩(wěn)定數(shù)月到一年。１.6.1.1.4實驗步驟１.6.1.1.4.1試劑2.5毫升於5毫升帶蓋試管中，加入10微升血液，混勻后，放置15分鐘。１.6.1.1.4.2選用0.5厘米光徑比色杯，于540nm波長下，以試劑調(diào)零點，將所得樣品管之光密度乘以73.6，即為血紅蛋白之濃度（克%）。計算公式如下：Ct=待測的血紅蛋白（克%）濃度。D540=氰化高鐵血紅蛋白在540nm波長下測出的光密度。HICN251=測定時血液的稀釋倍數(shù)（血10微升加入試劑2.5毫升中）44=氰化高鐵血紅蛋白的毫克分子消光系數(shù)0
3、.5=比色杯的光徑10000=將（毫克/升）換算成（克%）的數(shù)字１.6.1.1.5注意事項１.6.1.1.5.1試劑不要放在聚乙烯瓶內(nèi)，以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。１.6.1.1.5.2儀器因mM消光系數(shù)法完全依靠儀器的吸光度來計算,故此法要求所用的儀器性能要符合要求(如儀器的波長準確與否,以及靈敏度及線性等),否則將直接影響測定的結(jié)果。1.6.1.1.5.3儀器在使用前最好以WHO規(guī)定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正后再使用。參考液最好選用ICSH9國際血液學(xué)標準化委員會）確定的由RIV（蒞國立公共衛(wèi)生研究院）制定的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫(yī)學(xué)化
4、驗所制血的氰化高鐵血紅蛋白標準液。1.6.1.2標準曲線法1.6.1.2.1原理血紅蛋白（hemoglobin,Hb）在鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下生成極為穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白（紅色），其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計在540nm波長下，測定血紅蛋白標準品和參考標準物質(zhì)的吸光度，制成標準曲線，測得待測樣品的吸光度后查標準曲線即可各Hb的濃度。1.6.1.2.2儀器10ul血色素吸管（或定量毛細管）5毫升或10毫升帶蓋試管721、722或723型等型號的分光光度計結(jié)和力。從中可計算出未飽和鐵量及血清運鐵蛋白飽和度。1.6.1.2.3試劑稱取碳酸氫納
5、（）140、鐵氰化鉀２００mg、氰化鉀50mg，用蒸餾水溶解并稀釋到1000ml貯存于棕色試劑瓶內(nèi)，保存于４℃冰箱可穩(wěn)定至一年。1.6.1.2.４實驗步驟吸取2.5ml試劑于５ml帶蓋試管中，用10ul血色素吸管（或定量毛細管）取大鼠尾血或靜脈血10ul放置于已放入試劑的試管中；混勻放置15分鐘。選取0.5cm光徑比色杯，于540nm波長下，以試劑調(diào)節(jié)儀器零點，測定各樣品管的吸光度，同時測定血紅蛋白標準和參考標準物質(zhì)的吸光度，繪制血紅蛋白的標準曲線。查標準曲線可求得待測樣品和參考標準物質(zhì)得血紅蛋白含量g/dl或g/l，計算參考物質(zhì)的回收率。1.6.1.2.5
6、 注意事項1.6.1.2.5.1 不要將試劑放在聚乙烯瓶內(nèi)，以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系數(shù)方法計算血經(jīng)紅蛋白的含量，因為儀器的波長準確與否儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測定結(jié)果。1.6.1.2.5.3 每次測定時，在不同間隔反復(fù)測定血紅蛋白標準液和參考標準物質(zhì)（低、中、高３個濃度）。1.6.1.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定實驗數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程度先進行方差齊性檢驗，方差齊，計算Ｆ值，Ｆ值<Ｆ0.05，結(jié)論：各級均數(shù)間差異無顯著性；Ｆ值≥Ｆ0.05，Ｐ≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)
7、的兩兩比較方法進行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。結(jié)果判定受試樣品組與對照組比較，血紅蛋白濃度升高經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，且受試樣品組前后升高幅度達到10g/l以上，判定該受試樣品有升高血紅蛋白作用，動物實驗結(jié)果陽性。1.6.2血清運鐵蛋白飽和度測定1.6.2.1 原理血清中加入過量的鐵，使血清中的運鐵蛋白全部與鐵結(jié)合，達到飽和，過剩的鐵用碳酸鎂吸附除去，然后按測血清鐵的方法，測定總結(jié)合的鐵量，即為總鐵結(jié)合力。從中可計算出未飽和鐵
8、量及血清運鐵蛋白飽和度。1.6.2.2 試劑1.6.
