血紅蛋白測(cè)定方法

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1、6.1血紅蛋白測(cè)定（氰化高鐵法）　　消光系數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法任選其一測(cè)定血紅蛋白。１.6.1.1光系數(shù)法１.6.1.1.1原理血紅蛋白(haemoglobin，Hb)被鐵氰化鉀氧化后生成高鐵血紅蛋白，再生氰離子結(jié)合形成氰化高鐵血紅蛋白（紅色），氰化高鐵血紅蛋白（紅色）極為穩(wěn)定，在540nm波長(zhǎng)下，毫克分子消光系數(shù)為44，據(jù)此，用分光光度法測(cè)其光密度，運(yùn)用消光系數(shù)作血紅蛋白的定量測(cè)定。１.6.1.1.2儀器721型或其它型號(hào)的分光光度比色計(jì)。10微升量吸管。１.6.1.1.3試劑稱取碳酸氫納（）140毫克鐵氰化鉀200毫克、氰化鉀50毫克，用水溶解并稀釋到10

2、00毫升。貯存於棕色試劑瓶?jī)?nèi)，在暗處或冰箱（+4℃）保存，至少可穩(wěn)定數(shù)月到一年。１.6.1.1.4實(shí)驗(yàn)步驟１.6.1.1.4.1試劑2.5毫升於5毫升帶蓋試管中，加入10微升血液，混勻后，放置15分鐘。１.6.1.1.4.2選用0.5厘米光徑比色杯，于540nm波長(zhǎng)下，以試劑調(diào)零點(diǎn)，將所得樣品管之光密度乘以73.6，即為血紅蛋白之濃度（克%）。計(jì)算公式如下：Ct=待測(cè)的血紅蛋白（克%）濃度。D540=氰化高鐵血紅蛋白在540nm波長(zhǎng)下測(cè)出的光密度。HICN251=測(cè)定時(shí)血液的稀釋倍數(shù)（血10微升加入試劑2.5毫升中）44=氰化高鐵血紅蛋白的毫克分子消光系數(shù)0

3、.5=比色杯的光徑10000=將（毫克/升）換算成（克%）的數(shù)字１.6.1.1.5注意事項(xiàng)１.6.1.1.5.1試劑不要放在聚乙烯瓶?jī)?nèi)，以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。１.6.1.1.5.2儀器因mM消光系數(shù)法完全依靠?jī)x器的吸光度來(lái)計(jì)算,故此法要求所用的儀器性能要符合要求(如儀器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確與否,以及靈敏度及線性等),否則將直接影響測(cè)定的結(jié)果。1.6.1.1.5.3儀器在使用前最好以WHO規(guī)定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正后再使用。參考液最好選用ICSH9國(guó)際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)）確定的由RIV（蒞國(guó)立公共衛(wèi)生研究院）制定的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫(yī)學(xué)化

4、驗(yàn)所制血的氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。1.6.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線法1.6.1.2.1原理血紅蛋白（hemoglobin,Hb）在鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下生成極為穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白（紅色），其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計(jì)在540nm波長(zhǎng)下，測(cè)定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，測(cè)得待測(cè)樣品的吸光度后查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可各Hb的濃度。1.6.1.2.2儀器10ul血色素吸管（或定量毛細(xì)管）5毫升或10毫升帶蓋試管721、722或723型等型號(hào)的分光光度計(jì)結(jié)和力。從中可計(jì)算出未飽和鐵量及血清運(yùn)鐵蛋白飽和度。1.6.1.2.3試劑稱取碳酸氫納

5、（）140、鐵氰化鉀２００mg、氰化鉀50mg，用蒸餾水溶解并稀釋到1000ml貯存于棕色試劑瓶?jī)?nèi)，保存于４℃冰箱可穩(wěn)定至一年。1.6.1.2.４實(shí)驗(yàn)步驟吸取2.5ml試劑于５ml帶蓋試管中，用10ul血色素吸管（或定量毛細(xì)管）取大鼠尾血或靜脈血10ul放置于已放入試劑的試管中；混勻放置15分鐘。選取0.5cm光徑比色杯，于540nm波長(zhǎng)下，以試劑調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn)，測(cè)定各樣品管的吸光度，同時(shí)測(cè)定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度，繪制血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。查標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得待測(cè)樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)得血紅蛋白含量g/dl或g/l，計(jì)算參考物質(zhì)的回收率。1.6.1.2.5

6、　注意事項(xiàng)1.6.1.2.5.1　不要將試劑放在聚乙烯瓶?jī)?nèi)，以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。1.6.1.2.5.2　不宜直接使用消光系數(shù)方法計(jì)算血經(jīng)紅蛋白的含量，因?yàn)閮x器的波長(zhǎng)準(zhǔn)確與否儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測(cè)定結(jié)果。1.6.1.2.5.3　每次測(cè)定時(shí)，在不同間隔反復(fù)測(cè)定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（低、中、高３個(gè)濃度）。1.6.1.3　數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程度先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，方差齊，計(jì)算Ｆ值，Ｆ值<Ｆ0.05，結(jié)論：各級(jí)均數(shù)間差異無(wú)顯著性；Ｆ值≥Ｆ0.05，Ｐ≤0.05，用多個(gè)實(shí)驗(yàn)組和一個(gè)對(duì)照組間均數(shù)

7、的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果判定受試樣品組與對(duì)照組比較，血紅蛋白濃度升高經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理差異有顯著性，且受試樣品組前后升高幅度達(dá)到10g/l以上，判定該受試樣品有升高血紅蛋白作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性。1.6.2血清運(yùn)鐵蛋白飽和度測(cè)定1.6.2.1　原理血清中加入過(guò)量的鐵，使血清中的運(yùn)鐵蛋白全部與鐵結(jié)合，達(dá)到飽和，過(guò)剩的鐵用碳酸鎂吸附除去，然后按測(cè)血清鐵的方法，測(cè)定總結(jié)合的鐵量，即為總鐵結(jié)合力。從中可計(jì)算出未飽和鐵

8、量及血清運(yùn)鐵蛋白飽和度。1.6.2.2　試劑1.6.