柱前衍生化rp—hplc測(cè)定雞內(nèi)金中種氨基酸的含量

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1、柱前衍生化RP—HPLC測(cè)定雞內(nèi)金中16種氨基酸的含量　　[摘要]采用酸水解法制備水解氨基酸樣品溶液，以異硫氰酸苯酯（PITC）柱前衍生化后進(jìn)行HPLC分析。采用UltimatePrimeC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相A0.1mol·L-1醋酸鈉溶液（調(diào)pH至6.5）-乙腈（93∶7），流動(dòng)相B乙腈-水（8∶2）；流速1.0mL·min-1；柱溫40℃；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm；梯度洗脫。氨基酸衍生溶液在36h內(nèi)保持穩(wěn)定，16種氨基酸線性相關(guān)系數(shù)均大于0.9995，加樣回收率在98.01

2、%～101.8%。該方法操作簡(jiǎn)便，精密度和重復(fù)性良好，可用于雞內(nèi)金中16種水解氨基酸含量的測(cè)定?！　關(guān)鍵詞]雞內(nèi)金；氨基酸；衍生化；異硫氰酸苯酯；高效液相色譜　　[收稿日期]2013-10-10　　[基金項(xiàng)目]國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)科研項(xiàng)目；上海市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（13ZR1442000）　　[通信作者]修彥鳳，副教授，E-mail：xiuyf@hotmail.com　　[作者簡(jiǎn)介]梁琨，講師，E-mail：dolphin000000@163.com　　雞內(nèi)金為雉科動(dòng)物家雞Gallusgallusdomestic

3、usBrisson的干燥沙囊內(nèi)壁。殺雞后取出雞肫，立即剝下內(nèi)壁，洗凈，干燥。雞內(nèi)金性味甘，平，歸脾、胃、小腸、膀胱經(jīng)。具有健胃消食、澀精止遺、通淋化石的功效，用于食積不消、嘔吐瀉痢、小兒疳積遺尿、遺精、石淋澀痛、膽脹脅痛。近年來(lái)，隨著雞內(nèi)金在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，對(duì)雞內(nèi)金的質(zhì)量提出了更高的要求，而《中國(guó)藥典》2010年版僅以醇溶性浸出物和灰分為指標(biāo)，沒(méi)有指標(biāo)成分的含量測(cè)定?！　‖F(xiàn)代研究表明，雞內(nèi)金主要含有蛋白質(zhì)、多種氨基酸、維生素和微量元素等。氨基酸作為蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)單位和生物代謝過(guò)程中的重要物質(zhì)，是

4、人體的必需營(yíng)養(yǎng)成分之一。筆者利用PITC柱前衍生化方法針對(duì)雞內(nèi)金中16種氨基酸類(lèi)成分進(jìn)行了測(cè)定。　　1材料　　AgilentHPLC1100系統(tǒng)：四元泵、真空在線脫氣機(jī)、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、AgilentChemStation工作站；BT25S電子天平（1/10萬(wàn)，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；FE20pH計(jì)（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）。　　16種氨基酸對(duì)照品，批號(hào)分別為L(zhǎng)-天冬氨酸（Asp）110103，L-谷氨酸（Glu）110109，L-絲氨酸（Ser）120116，L-甘氨酸（Gl

5、y）120301，L-組氨酸（His）120112，L-精氨酸（Arg）101201，L-蘇氨酸（Thr）120113，L-丙氨酸（Ala）120117，L-脯氨酸（Pro）100311，L-酪氨酸（Tyr）120201，L-纈氨酸（Val）120113，L-蛋氨酸（Met）110125，L-異亮氨酸（Ile）110801，L-亮氨酸（Leu）120117，L-苯丙氨酸（Phe）090712，L-賴氨酸（Lys）100423，以上對(duì)照品均購(gòu)自上海友思生物技術(shù)有限公司，純度均≥98%；10批雞內(nèi)金分別購(gòu)買(mǎi)于

6、安徽（1）、湖南（2）、浙江（3）、上海（4）、內(nèi)蒙古（5）、廣東（6）、江蘇（7）、云南（8）、河北（9）、山東（10），由上海中醫(yī)藥大學(xué)修彥鳳副教授鑒定為雉科動(dòng)物家雞G.gallusdomesticus的干燥沙囊內(nèi)壁。　　異硫氰酸苯酯（PITC）純度標(biāo)示量為97.0%（AlphaAesar公司）；乙腈為色譜純（美國(guó)Fisher公司）；醋酸鈉、三乙胺、鹽酸、正己烷、冰醋酸均為分析純，購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上海公司；純凈水為Milli-Q純水?！　?方法與結(jié)果　　2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)　　UltimateP

7、rimeC18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；流動(dòng)相A0.1mol·L-1醋酸鈉溶液（以冰醋酸調(diào)pH為6.5）-乙腈（93∶7），流動(dòng)相B乙腈-水（8∶2），梯度洗脫程序見(jiàn)表1；流速1.0mL·min-1；柱溫40℃；進(jìn)樣量5μL；檢測(cè)波長(zhǎng)254nm?！　?.2溶液的制備及衍生化　　2.2.1混合對(duì)照品儲(chǔ)備溶液的制備精密稱取16種氨基酸對(duì)照品于量瓶中，用0.1mol·L-1鹽酸溶液定容，配制成每1mL分別含L-天冬氨酸（Asp）0.3292mg，L-谷氨酸（Glu）0.3328mg，L-絲氨酸（

8、Ser）0.2620mg，L-甘氨酸（Gly）0.2836mg，L-組氨酸（His）0.3928mg，L-精氨酸（Arg）0.4380mg，L-蘇氨酸（Thr）0.2916mg，L-丙氨酸（Ala）0.2244mg，L-脯氨酸（Pro）0.2932mg，L-酪氨酸（Tyr）0.4496mg，L-纈氨酸（Val）0.2904mg，L-蛋氨酸（Met）0.3688mg，L-異亮氨酸（Ile）0.3312mg，L-亮氨酸（Leu）0