腎腫瘤中浸潤(rùn)性樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫狀態(tài)變化.doc

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1、腎腫瘤中浸潤(rùn)性樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫狀態(tài)變化作者：閆東，王勤章，張國(guó)璽，倪釗，李應(yīng)龍，王新敏，謝順明，王江平，楊安強(qiáng)，丁國(guó)富【摘要】目的通過(guò)分析腎腫瘤中浸潤(rùn)性樹(shù)突狀細(xì)胞的免疫狀態(tài)變化，以探討其在腎腫瘤微環(huán)境中的功能狀態(tài)。方法選擇未經(jīng)任何非手術(shù)治療的腎透明細(xì)胞癌患者標(biāo)本40例作為實(shí)驗(yàn)組，10例正常腎組織作為對(duì)照組，通過(guò)免疫組織化學(xué)技術(shù)標(biāo)記組織中樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell,DC)的CD1a、HLA-DR和CD86抗原，觀察正常腎及腎透明細(xì)胞癌組織中DC的3種抗原的表達(dá)，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果所有腎透明細(xì)胞癌組織中均未見(jiàn)明顯CD86+DC，

2、但均有CD1a+DC，其在腎癌組織中的浸潤(rùn)程度明顯高于正常腎組織(P<0.001)，但CD1a+DC與腎癌臨床分期及組織學(xué)分級(jí)均無(wú)相關(guān)性；在腎癌組中有34例癌實(shí)質(zhì)內(nèi)的DC表達(dá)HLA-DR抗原，其陽(yáng)性表達(dá)率為85%，與正常腎組織80%的陽(yáng)性表達(dá)率相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論DC具有趨化性，可以向腫瘤組織聚集，腎癌組織中存在CD1a，腎癌患者CD86表達(dá)低下，提示腎癌患者DC存在免疫缺陷，而DC的免疫功能低下則可能是腎癌逃避宿主免疫監(jiān)視的主要原因。【關(guān)鍵詞】樹(shù)突狀細(xì)胞；腎腫瘤；免疫狀態(tài)樹(shù)突狀細(xì)胞(dendriticcell,

3、DC)是目前已知功能最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞(antigen-presentingcell,APC)，能誘導(dǎo)針對(duì)腫瘤相關(guān)抗原的特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)，DC最大的特點(diǎn)是能夠顯著刺激初始型T細(xì)胞(naiveTcells)增殖，其抗原提呈能力是其他抗原提呈細(xì)胞的10-100倍［1］。諸多的研究證實(shí)，DC能在體外攝取腫瘤抗原，并在體內(nèi)激活初始T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性，從而在腫瘤免疫中發(fā)揮重要的作用。然而，腫瘤宿主本身DC并沒(méi)有激發(fā)機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生有效的抗腫瘤效應(yīng)，說(shuō)明腫瘤微環(huán)境中的DC，即腫瘤浸潤(rùn)性DC(tumorinfiltratingdendriticc

4、ell,TIDC)可能存在免疫缺陷，從而導(dǎo)致腫瘤的免疫逃逸。因此研究TIDC有助于揭示腫瘤免疫逃逸的機(jī)制。本文采用免疫組化技術(shù)，對(duì)40例腎癌患者TIDC的免疫狀態(tài)進(jìn)行分析，以探討腎癌中TIDC與腫瘤免疫的關(guān)系。1材料與方法1.1材料1.1.1標(biāo)本收集5在新疆石河子大學(xué)第一附屬醫(yī)院1990-2006年收治的腎腫瘤患者中，篩選出初發(fā)并且未經(jīng)任何非手術(shù)治療患者的手術(shù)切除標(biāo)本40例，男性26例，女性14例，年齡38-73歲，平均55歲。術(shù)后病理證實(shí)為腎透明細(xì)胞癌作為實(shí)驗(yàn)組。組織學(xué)分級(jí)以往最常用的是1982年Fuhrman四級(jí)分類(lèi)［2-3］。1997年

5、WHO推薦將Fuhrman分級(jí)中的Ⅰ、Ⅱ級(jí)合并為1級(jí)即高分化、Ⅲ級(jí)為中分化、Ⅳ級(jí)為低分化或未分化。故采用將腎癌分為高分化、中分化、低分化(未分化)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)［4］。分期采用2002年AJCC的TNM分期和臨床分期［2］。40例腎透明細(xì)胞癌中高分化28例，中分化9例，低分化(未分化)3例；臨床Ⅰ期29例，Ⅱ期9例，Ⅲ-Ⅳ期2例。另外,收集該院的正常腎組織標(biāo)本10例作為對(duì)照組。1.1.2主要試劑和設(shè)備鼠抗人CD1a(購(gòu)自中國(guó)福州邁新公司)，鼠抗人CD86(購(gòu)自R&DSystems公司，英國(guó))，鼠抗人HLA-DR(購(gòu)自上海基因公司)。免疫組

6、化成套試劑盒(購(gòu)自中國(guó)福州邁新公司)。1.2方法1.2.1標(biāo)本處理及切片制作所有標(biāo)本均經(jīng)10%(體積分?jǐn)?shù))中性甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，取4μm厚的連續(xù)切片，置于65℃烘箱內(nèi)烘烤6h以上備用。1.2.2免疫組化染色(S-P法)按有關(guān)試劑的產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。常規(guī)脫蠟至水，滴加過(guò)氧化物酶阻斷劑10min后行抗原修復(fù)。依次滴加一抗，生物素標(biāo)記的二抗。每步驟后均用緩沖液(PBS)洗滌5min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，干燥，中性樹(shù)膠封片?？乖迯?fù)方法：針對(duì)CD1a、HLA-DR及CD86采用不同的抗原修復(fù)方法。CD1a于二氨四乙酸二鈉(ethyl

7、enediaminete-traacetic，EDTA)(pH8.0)修復(fù)液，HLA-DR、CD86于枸櫞酸緩沖液(pH6.0)修復(fù)液中，微波爐強(qiáng)火3min左右至煮沸，微波爐低火5min，連續(xù)3次。實(shí)驗(yàn)對(duì)照：以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照,以正常腎組織作為陽(yáng)性對(duì)照。1.2.3計(jì)數(shù)方法由3位病理科主治醫(yī)師閱片。每張切片任意取DC分布最密集的5個(gè)區(qū)，在高倍視野下(HPF×400)計(jì)數(shù)CD1a陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)目。以5個(gè)高視倍視野下CD1a陽(yáng)性細(xì)胞平均數(shù)代表該標(biāo)本切片中的DC浸潤(rùn)程度。采用成組資料樣本均數(shù)的t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的CD1a+DC浸潤(rùn)程

8、度。HLA-DR以細(xì)胞膜或胞漿染成黃色、棕色或棕褐色且其染色強(qiáng)度高于背景非特異染色者為陽(yáng)性細(xì)胞；同一陽(yáng)性片中，不同區(qū)域染色強(qiáng)弱不盡相同。按許良中［5］等級(jí)評(píng)分方法，