雞胚接種技術

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1、第二章雞胚接種技術一、概況1911年Rous和Murphy首先應用雞胚培養(yǎng)研究肉瘤病毒(Rous肉瘤)的繁殖。1938年Goodpasture和Burnet等應用雞胚繁殖病毒、Cox應用卵黃囊培養(yǎng)立克次體。雞胚培養(yǎng)法的優(yōu)點：雞胚的組織分化程度低，可選擇適當途徑接種，病毒易復制，感染病毒的膜和液體含大量病毒。雞胚是一整體，有神經血管的分布及臟器的構造。來源充足，操作簡單，通常是無菌的，對接種的病毒不產生抗體。雞胚培養(yǎng)法的缺點：一般的病毒通常不使雞胚產生特異性的感染指征。卵黃中常常含有抗家禽病原體的母體抗體。某些細菌、

2、衣原體和病毒能夠從感染的母雞傳遞到雞胚。通常雞胚含有白血病病毒。在雞食物中加入抗菌素，母雞吃后會傳遞給雞胚，雞胚就會產生對立克次體和衣原體感染的抵抗。第一節(jié)雞胚的結構與生理雞胚是由三個胚層發(fā)育起來的，即外胚層、中胚層和內胚層，它們構成胚胎的組織與器官。（約10日齡雞胚的結構見圖）卵殼與殼膜卵殼位于最外層的堅硬殼層；殼膜位于卵殼的下層，允許氣體和液體分子交換，因此培養(yǎng)雞胚需一定的濕度和氣體。氣室功能主要是呼吸和調節(jié)壓力。絨毛尿囊膜殼膜之下，主要是胚胎的呼吸器官。羊膜胚胎的最內層包被，含羊水，胚胎在其中。尿囊腔位于絨毛

3、尿囊腔和羊膜之間，胚胎排泄器官含5－20ml尿囊液，含大量的尿酸鹽，為減少沉淀，鹽水稀釋再4℃保存。卵黃囊主要營養(yǎng)的儲藏場所，為胚胎提供營養(yǎng)。卵白外于卵的銳端，為胚胎發(fā)育晚期提供營養(yǎng)。第二節(jié)雞胚的孵育和檢查受精雞卵的供給—沒有受到病毒和細菌的污染如新城雞瘟病毒、布氏桿菌等；—培養(yǎng)立克次體和衣原體，不能來自食用抗生素的雞群。雞胚的孵育—溫度為38～39℃；—濕度為40％-70％；—翻蛋：防止蛋白粘連，促進羊膜運動和空氣流通；—通風：排出CO2和吸入O2。檢卵—血管：活胚可見清晰的血管，有時可見血管搏動，死胚血管模糊成

4、淤血帶或淤血塊?！樱夯钆呖梢娒黠@的自然運動，尤其在轉動胚胎時，死胚見不到任何胎動，胚胎發(fā)紅像出血樣，有的呈現(xiàn)黑塊?！q毛尿囊膜發(fā)育界限：發(fā)育好的雞胚可見密布豐滿的血管網(wǎng)，也就是絨毛尿囊膜，死胚則見不到這一現(xiàn)象。第三節(jié)雞胚接種途徑及方法（一）羊膜腔接種應用于從臨床材料中分離流感病毒等，病毒感染后可收集羊水和尿囊液。接種步驟與方法將10~12日齡的雞胚在檢卵燈上照視，標記氣室及胚胎的位置。消毒氣室部位的蛋殼，在氣室頂端鉆出一約10mm×6mm的長方形裂痕，注意勿鉆破殼膜。再次消毒鉆孔區(qū)后，用滅菌的小鑷子除去長方形卵

5、殼和外層殼膜，并滴加滅菌液體石蠟一滴于下層殼膜上，使其透明，以便觀察胚胎的位置。將注射器刺向胚胎的腭下胸前，以針頭撥動下顎及腿，當進入羊膜腔內時，可看到雞胚隨針頭的撥動而動，此時可注入O.1～0.2ml病毒液。拔出針頭，孔區(qū)消毒后用沾有碘酒通過火焰的小塊膠布將卵殼的窗口封住，于33～35℃孵育48～72h，要保持雞胚鈍端朝上。羊膜腔接種法解剖與收獲收獲前雞胚須置4℃冰箱6h或過夜，但不能放置時間過長(過長會引起散黃)。如急于收獲亦可置-20℃冰箱lh左右。預冷的目的是，將雞胚凍死，使血液凝固，避免收獲時流出紅細胞，

6、并同尿囊液的病毒發(fā)生凝集，造成病毒滴度下降。病毒通過胚胎機體后被排泄入尿囊腔，因此當羊水過少時，可用同胚少量尿囊液沖洗羊膜腔并吸取該洗液。（二）絨毛尿囊膜接種常用于牛痘病毒、天花病毒、單純皰疹病毒的分離，因為這些病毒在絨毛尿囊膜上可形成肉眼可見的斑點狀或痘皰狀病灶。另外，病毒可在絨毛尿囊膜上進行滴定，因為感染性病毒顆粒的數(shù)目可以通過產生的斑和痘的數(shù)目來計算。該方法還可用于抗病毒血清的滴定試驗，即在有抗體存在的情況下，痘皰形成受到抑制。將孵育l0~13日齡的雞胚標記氣室、胎位，于與胚胎略近氣室端卵殼上劃一等邊三角形。

7、消毒氣室頂端及記號處，用開孔器在記號處的卵殼上開一三角形裂痕，不可弄破下面的殼膜，同時在氣室頂端鉆一小孔。輕輕揭去卵殼，露出殼膜，在殼膜上滴一滴生理鹽水，用針尖循卵殼膜纖維方向劃破一隙，勿傷及緊貼的絨毛尿囊膜。用針尖刺破氣室小孔處的殼膜，再用橡皮乳頭緊按氣室小孔向外吸氣，此時鹽水小滴即可自裂隙流至絨毛尿囊膜上，從而使絨毛尿囊膜下陷而形成人工氣室。在卵殼的窗口滴0.05~0.1ml病毒液于絨毛尿囊膜上，然后將旋轉雞胚使接種物擴散到整個絨毛膜尿囊膜上。在卵殼的窗口周圍涂石蠟，用消毒膠布封口。將雞胚保持人工氣室在上的位置

8、，33~35℃繼續(xù)培養(yǎng)48～72h。接種步驟與方法絨毛尿囊膜接種法解剖與收獲用剪刀沿人工氣室邊緣將膜剪下，放入加有滅菌生理鹽水的培養(yǎng)皿內，觀察病灶形狀或用于傳代，或用50％甘油保存。同時作無菌培養(yǎng)。（三）尿囊腔接種廣泛應用于流感病毒、流行性腮腺炎病毒和新城疫病毒的適應和傳代培養(yǎng)，這些病毒被接種到尿囊腔后，可在內皮細胞中復制，復制的病毒被釋放到尿囊液中，因此，