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1、流感病毒裂解疫苗中外源性禽白血病病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究劉巍2015年12月中圖分類(lèi)號(hào)：TQ028.1UDC分類(lèi)號(hào)：540流感病毒裂解疫苗中外源性禽白血病病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的研究作者姓名劉巍學(xué)院名稱(chēng)生命學(xué)院指導(dǎo)教師慶宏教授答辯委員會(huì)主席戴榮繼教授申請(qǐng)學(xué)位工學(xué)碩士學(xué)科專(zhuān)業(yè)生物工程學(xué)位授予單位北京理工大學(xué)論文答辯日期2015年12月Studyofreal-timequantitativePCRfordetectionofexogenousALVinsplitinfluenzavirusvaccineCandidateName：We
2、iLiuSchoolorDepartment:SchoolofLifeScienceFacultyMentor:Prof.HongQingChair,ThesisCommittee：Prof.RongJiDaiDegreeApplied:MasterofEngineeringMajor：Bio-engineeringDegreeby:BeijingInstituteofTechnologyTheDateofDefence：December，2015研究成果聲明本人鄭重聲明：所提交的學(xué)位論文是我本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作獲得的研究成果
3、。盡我所知，文中除特別標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得北京理工大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書(shū)所使用過(guò)的材料。與我一同工作的合作者對(duì)此研究工作所做的任何貢獻(xiàn)均已在學(xué)位論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。特此申明。簽名：日期：摘要流感病毒裂解疫苗作為預(yù)防大規(guī)模流感疫情的重要預(yù)防手段，能有效的預(yù)防流感引起的疾病和死亡。接種流感疫苗是被公認(rèn)的預(yù)防流感發(fā)生與傳播的最佳方法，用雞胚作為病毒生長(zhǎng)介質(zhì)也是目前流感疫苗生產(chǎn)最常用的培養(yǎng)基質(zhì)。在2010版《中國(guó)藥典》新增流感病毒裂解疫苗品種，其中規(guī)定明確要求對(duì)其主
4、種子批中的外源性禽白血病病毒(AvianLeucosisVirus，ALV)進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果應(yīng)為陰性。禽白血病病毒的檢測(cè)目前主要依賴(lài)于病毒分離培養(yǎng)及酶聯(lián)免疫吸附。血清學(xué)診斷由于檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需制備特異性抗體，存在生物安全隱患等不足之處。隨著分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，為禽白血病病毒的準(zhǔn)確檢定提供了可能。應(yīng)用普通PCR和RT-PCR方法可在1天內(nèi)進(jìn)行禽白血病病毒的鑒定和分型診斷，但兩種方法均易造成標(biāo)本間的交叉污染而得到假陽(yáng)性結(jié)果。Taqman實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，相對(duì)于常規(guī)的PCR技術(shù)而言，具有更高的敏感性、特異性。而且還具有快速、高通量、污染
5、少等優(yōu)點(diǎn)。從GenBank下載ALV-A、ALV-B、ALV-C、ALV-J等病毒基因組序列，尋找位于LTR區(qū)域的保守序列，設(shè)計(jì)引物探針。擴(kuò)增保守區(qū)，獲得質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，將含有保守序列的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品經(jīng)過(guò)10倍系列稀釋后，進(jìn)行熒光定量PCR得到相應(yīng)的擴(kuò)增曲線(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)相關(guān)系數(shù)R2=0.998，擴(kuò)增效率Eff=96.5%所做的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的有較好的線(xiàn)性關(guān)系。倍比稀釋質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，從1×109稀釋到1×101copies/μL?？疾炱涿舾行?，敏感性可達(dá)到10-1copies/μL。用建立的熒光定量PCR方法對(duì)ALV-A、ALV-B、ALV-C、
6、ALV-J等標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行檢測(cè)，均可出現(xiàn)“S”型擴(kuò)增曲線(xiàn)。說(shuō)明該方法可檢測(cè)四種亞型的禽白血病病毒。用建立的熒光定量PCR方法對(duì)小鼠白血病病毒、H1N1型流感病毒、H7N9型流感病毒等進(jìn)行檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)果皆為陰性。表明所建立的針對(duì)外源性禽白血病病毒的熒光定量PCR方法特異性強(qiáng)，與其他病毒無(wú)交叉反應(yīng)。本研究成功設(shè)計(jì)了針對(duì)外源性禽白血病病毒的特異性引物和探針，可實(shí)現(xiàn)對(duì)流感病毒裂解疫苗主種子批中的禽白血病病毒的快速檢定，具有快速、敏感、特異等特點(diǎn)，并可對(duì)樣品中病毒進(jìn)行定量。I關(guān)鍵詞：禽白血病病毒；外源性；熒光定量PCRIIAbstractInfluenz
7、avirusvaccineasanimportantmeansofpreventionofthepandemicoutbreakcaneffectivelypreventflu-relatedillnessanddeath.Nowthereisnotspecificmedicinetocureanyonefromgettingtheflu,butvaccinationisregardedasthebestmethodofinfluenzaprevention.Fertilizedhens’eggisthecommonchoiceinmanuf
8、acturinginfluenzavaccine.Inthe2010editionoftheChinesePharmacopoeiaaddedinfluenzavi
