rna干擾分化抑制因子

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1、RNA干擾分化抑制因子作者：曾達(dá)武，方明霞，劉豫瑞【摘要】目的研究針對(duì)分化抑制因子-1的siRNA(si-Id-1)對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)細(xì)胞增殖和凋亡影響的可能機(jī)制。方法陽離子脂質(zhì)體法介導(dǎo)si-Id-1轉(zhuǎn)染ESCCTE-1細(xì)胞株，倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化并計(jì)算轉(zhuǎn)染率，RT-PCR檢測(cè)Id-1的mRNA表達(dá)水平;免疫印跡法檢測(cè)Id-1的蛋白表達(dá)水平;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染前后TE-1細(xì)胞增殖能力變化;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞的周期變化和凋亡指數(shù)。結(jié)果si-Id-1轉(zhuǎn)染前后的TE-1細(xì)胞株Id-1的mRNA

2、和蛋白表達(dá)水平有明顯差異(P<0.05);轉(zhuǎn)染后的TE-1細(xì)胞較其親代細(xì)胞增殖能力降低，凋亡程度增強(qiáng)(P<0.05);轉(zhuǎn)染后的TE-1細(xì)胞周期停滯在G0/G1期，G1期細(xì)胞數(shù)增多，S期細(xì)胞數(shù)減少(P<0.05)。結(jié)論利用脂質(zhì)體將si-Id-1轉(zhuǎn)染至ESCC的TE-1細(xì)胞是切實(shí)可行的;si-Id-1可以有效沉默TE-1細(xì)胞Id-1的表達(dá)，從而抑制ESCC細(xì)胞增殖?！娟P(guān)鍵詞】抑制因子，免疫;癌，鱗狀細(xì)胞;食管腫瘤;RNA，小分子干擾;細(xì)胞凋亡;細(xì)胞增殖在我國(guó)，食管癌具有高發(fā)病率及高病死率，以手術(shù)為主輔以放

3、射治療或化學(xué)治療的綜合治療可提高患者生存率，但仍有90%的患者死于轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)[1]，因此尋求新的切實(shí)有效的食管癌治療方法或策略迫在眉睫。分化抑制因子(inhibitorofDNAbindingordifferentiation,Id-1)可在食管癌、肝癌等腫瘤中表達(dá)，參與腫瘤血管發(fā)生、促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移[2-4];而小分子干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)可有效沉默目標(biāo)基因，而不影響正?；騕5]。該研究針對(duì)si-Id-1對(duì)人食管鱗狀細(xì)胞癌(ESCC)TE-1細(xì)胞增殖、凋亡、細(xì)胞周期的

4、影響，探討其對(duì)ESCC增殖和凋亡影響的可能機(jī)制?！　?材料與方法　　1.1主要試劑Id-1-siRNA、Lipofectamine2000(廣州銳博生物公司)，人食管鱗狀細(xì)胞癌ESCCTE-1細(xì)胞(上海拜力生物公司，ATCC來源)，TrizolReagent(美國(guó)Invitrogen公司)，RT-PCR試劑盒(美國(guó)Fermentas公司)，兔抗人Id-1多克隆抗體、I1640培養(yǎng)液，于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。以105mL-1的細(xì)胞密度接種培養(yǎng)，細(xì)胞80%融合后，用Lipo

5、fectamine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。3組siRNA均由廣州銳博生物公司設(shè)計(jì)與合成?！　i-Id-1-001(19bp)：　　5'-UGAGCAAGGUGGAGAUUCUdTdT-3'　　3'-dTdTACUCGUUCCACCUCUAAGA-5'　　Si-Id-1-002(19bp)：　　5'-CAUGAACGGCUGUUACUCAdTdT-3'　　3'-dTdTGUACUUGCCGACAAUGAGU-5'　　Si-Id-1-003(19bp)：　　5'-GUUGGAGCUGAACUCGGAAdTdT-3'　　

6、3'-dTdTCAACCUCGACUUGAGCCUU-5'　　另外，本實(shí)驗(yàn)還將標(biāo)記FAM的siRNA同時(shí)轉(zhuǎn)染至TE-1細(xì)胞，分別于轉(zhuǎn)染6，24，48和60h后通過熒光倒置顯微鏡觀察含有熒光的細(xì)胞所占比例以及轉(zhuǎn)染前后的細(xì)胞形態(tài)變化，據(jù)此估計(jì)siRNA的轉(zhuǎn)染效率?！　?.3.2RT-PCR檢測(cè)Id-1的mRNA表達(dá)用Trizol一步法提取TE-1細(xì)胞總RNA，聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定，紫外分光光度計(jì)測(cè)純度并定量。然后以mRNA為模板，Oligo(dT)18為引物，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，反應(yīng)總體積為20μL，RT-PCR反應(yīng)條件為

7、42℃孵育60min，70℃中止10min。Id-1的PCR反應(yīng)引物由上海生物工程公司設(shè)計(jì)和合成，擴(kuò)增片段大小為416bp。　　上游引物(Id1-P1)：　　5'-CAGCACGTCATCGACTACATCA-3'　　下游引物(Id1-P2)：　　5'-GAATCCCACCCCCTAAAGTCTC-3'　　以β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)的一段擴(kuò)增序列為內(nèi)對(duì)照，擴(kuò)增片段大小為556bp。　　上游引物(β-actin-P1)：　　5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'　　下游引物(β-actin-P2)

8、：　　5'-TTTTAGGATGGCAAGGGACTTC-3'　　反應(yīng)體系：1×PCRBuffer，dNTP0.2mmol/L，cDNA模板200ng，引物濃度0.4μmol/L，Taq酶1.25U，反應(yīng)總體積25μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min;94℃30s→57℃30s→72℃45s，共30個(gè)循環(huán);72℃最后延伸7min。