成人脂肪來源干細胞定向誘導分化為軟骨細胞的實驗研究

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1、成人脂肪來源干細胞定向誘導分化為軟骨細胞的實驗研究作者：梁篤,樊粵光,王海彬魯峰【摘要】【目的】誘導脂肪組織來源干細胞(ADSCs)定向分化為軟骨細胞并進行鑒定，為軟骨組織工程獲取大量種子細胞做準備?！痉椒ā繉颊叱橹g(shù)的脂質(zhì)部分進行分離培養(yǎng)及傳代，采用四氮唑復合物(MTT)法測定細胞活性并描繪細胞增殖曲線，通過流式細胞儀將培養(yǎng)的細胞行干細胞鑒定，將第4代的ADSCs向軟骨細胞定向誘導分化并行阿新藍染色鑒定;免疫組化檢測成軟骨方向誘導后的ADSCsⅡ型膠原的表達。【結(jié)果】ADSCs體外增殖速度快，并且保持穩(wěn)定的倍增率直至13～15代;流式細胞儀分析提示該細胞具有干細胞特性;通過定向分化技術(shù)

2、，ADSCs可向軟骨細胞分化，阿新藍染色及Ⅱ型膠原表達均呈陽性，說明定向分化后的細胞具備正常軟骨細胞的功能。【結(jié)論】成功誘導ADSCs向軟骨細胞定向分化，為軟骨組織工程提供了可靠的種子細胞?！娟P(guān)鍵詞】脂肪組織來源干細胞;軟骨細胞/病理學;組織工程;細胞培養(yǎng)軟骨細胞來源不足一直是制約軟骨組織工程應用的重大難題，由于軟骨細胞取材復雜，而且難以一次獲得足夠的細胞數(shù)量以滿足組織工程的需要，因此探索軟骨細胞的其他來源具有重要的意義。干細胞為具有多向分化潛力的細胞，對干細胞進行定向誘導可分化為軟骨細胞。脂肪來源干細胞(ADSCs)具有一般干細胞的特點，而且比其他細胞有以下優(yōu)勢：(1)獲取容易;(2)體

3、外增殖速度快，且不必進行永生化就能獲得足夠的細胞用于移植;(3)ADSCs能夠進行自體移植，無免疫排斥反應等[1-6]。脂肪干細胞所具有的修復、替代和再生能力為臨床醫(yī)學提供了一個發(fā)展新療法的機會。本研究對成人ADSCs進行了定向誘導分化，現(xiàn)報道如下?！　?材料與方法　　11組織來源脂肪組織來自于南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院整形外科住院病人腹部及大腿脂肪抽脂術(shù)獲得的脂質(zhì)部分,供體無傳染病及內(nèi)分泌疾病,男女不限,抽取前均獲得供體本人同意，并承諾只用于試驗研究，平均脂肪抽吸物100mL?！　?2主要試劑和儀器DMEM培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液(PBS)、胎牛血清(FBS)均由美國Gibco公司提供;Ⅰ

4、型膠原酶、胰蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)、四氮唑復合物(MTT)、硫酸酚嗪甲酯(PMS)、吲哚鎂辛、胰島素、二甲基亞砜(DMSO)、地塞米松均由美國Sigma公司提供;鼠抗人CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLADR單克隆抗體均由美國Zymed公司提供;CO2培養(yǎng)箱(德國SHELLAB公司);離心機(德國Heraus公司);倒置顯微鏡(日本Nikon公司);酶標儀(日本Rader公司);BH光學顯微鏡、顯微照相系統(tǒng)(日本Olympus公司);SEM+10%FBS中和酶活性，200μm篩網(wǎng)過濾，1300r/min離心5min，DMEM+10%FBS重懸后，細胞懸液用

5、細胞記數(shù)板記數(shù)，按1×104~2×104接種于25cm2培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)瓶中加入完全培養(yǎng)基,置入37℃、體積分數(shù)為5%的CO2孵箱中培養(yǎng),48h換液后每3~4d換液1次。原代細胞培養(yǎng)7～10d即可融合傳代?！　?4細胞傳代棄去原培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，以去除血清，加入適量25g/L胰蛋白酶+038g/L乙二胺四乙酸(EDTA)(覆蓋瓶底即可)進行消化，于室溫下消化約1min，在倒置顯微鏡下觀察見胞質(zhì)回縮、細胞間隙增大，立即吸出消化液，加入適量基礎培養(yǎng)基終止消化，用吸管反復輕柔吹打，將細胞吹打下來，800r/min離心5min，以含體積分數(shù)10%胎牛血清，10g/L青、鏈霉素原液的高糖D

6、MEM培養(yǎng)基重懸沉積細胞，按1∶2的比例進行傳代。當傳代細胞生長接近單層匯合80%時，可繼續(xù)傳代?！　?5MTT法測定細胞活性并描繪細胞增殖曲線[8]收集第3代ADSCs，接種于96孔板，每孔2×103個細胞，加完全培養(yǎng)基200μL,設每組4個復孔。置37℃、體積分數(shù)為5%CO2孵箱培養(yǎng)8d，每天取1組細胞，吸棄上清,每孔加入50μLMTT-PMS工作液(1485mmol/LMTT、5mmol/LPMS,混合比例為200∶1),繼續(xù)培養(yǎng)4h。振蕩5min,以主波長450nm,參比波長630nm在酶標儀上比色,測定吸光度D值，取其均值，以時間為橫軸，D值為縱軸繪制出ADSCs生長曲線，并

7、計算細胞倍增時間?！　?6干細胞標記鑒定取培養(yǎng)擴增后第4代的ADSCs，去掉培養(yǎng)液，用1∶1的25g/L的胰蛋白酶和02g/LEDTA混合消化，用含10g/L牛血清白蛋白(BSA)的PBS洗滌后制成含有15×106個ADSCs的單細胞懸液，等分為7份，分別加入7個Eppendorf管中，一號管加入20μL對照試劑，其他試管分別加入CD29、CD34、CD44、CD106、CD133、HLADR單克隆抗體各20μ