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1、利用SSR分子標記鑒定雜交稻種子齊兩優(yōu)918純度摘要：種子純度是雜交水稻種子質量的核心指標。微衛(wèi)星技術（SSR分子標記技術）因其具有穩(wěn)定性好、準確可靠、易于操作等優(yōu)點在種子純度鑒定中得到了越來越廣泛的應用。采用48個SSR分子標記對雜交水稻組合齊兩優(yōu)918的雙親及F1之間的多態(tài)性進行篩選和純度檢測技術研究，為種子生產以及種子上市銷售做好質量監(jiān)督，杜絕質量風險。經過篩選得到如下結果：在對48對引物進行篩選后，發(fā)現(xiàn)有5對引物在雙親間顯示穩(wěn)定多態(tài)性，在雜種F1上表現(xiàn)為父母本共顯性條帶，表明該5對引物適宜于齊兩優(yōu)918雜交種子純度鑒定，可用于種子質量
2、監(jiān)控。關鍵詞：雜交水稻；種子純度鑒定；微衛(wèi)星分子標記（SSR分子標記）中圖分類號S511文獻標識碼A文章編號1007-7731（2013）17-120-02種子純度是雜交水稻種子質量的核心指標，是種子質量分級的主要標準，是企業(yè)購銷種子的關鍵依據(jù)，歷來受到種子管理部門、種子企業(yè)和農民的密切關注。而無論三系還是兩系雜交稻，高純度雜交種都是發(fā)揮雜種優(yōu)勢增產潛力的基礎，種子純度不夠會給種植戶造成減產和巨大的經濟損失。品種純度檢驗的方法很多，根據(jù)其所依據(jù)的原理不同主要分為形態(tài)鑒定、物理化學法鑒定、生理生化法鑒定、分子生物學方法鑒定、細胞學方法鑒定。其中
3、分子測定技術又分為RFLP、AFLP、RAPD、SSR分子檢測技術。而SSR(SimpleSequenceRepeats,簡單重復序列)分子技術是近年來發(fā)展起來的一種以特異引物PCR為基礎的分子標記技術，也稱為微衛(wèi)星DNA(MicrosatelliteDNA)技術，其SSR標記是一類由幾個核昔酸(一般為1?6個)為重復單位組成的長達幾十個核昔酸的串聯(lián)重復序列，具有以下優(yōu)點：(1)數(shù)量豐富，覆蓋了整個基因組，揭不的多態(tài)性高；(2)具有多等位基因的特性，提供的信息量高；(3)以孟德爾方式進行遺傳,呈共顯性；(4)每個位點由設計的引物順序決定，便于
4、不同的實驗室之間相互交流合作開發(fā)特異性引物。因而SSR分子檢測技術在種子純度鑒定中得到了廣泛應用。筆者利用SSR分子檢測技術，對齊兩優(yōu)918母本033S和父本R918進行擴增反應和電泳圖譜的分析，結果選出了5對引物，這5對引物對齊兩優(yōu)918的母本033S和父本R918都顯示出了很好的多態(tài)性，并在齊兩優(yōu)918±顯示出共顯性特征，因此適宜于對其進行純度鑒定以及質量監(jiān)控。1材料與方法1.1實驗材料水稻種子齊兩優(yōu)918的不育系033S在光照培養(yǎng)箱(恒溫30°C)中培養(yǎng)生長7d的幼苗；恢復系R918在光照培養(yǎng)箱（恒溫30°C）中培養(yǎng)生長7d的幼苗；雜交
5、種（F1）齊兩優(yōu)918在光照培養(yǎng)箱（恒溫30°C）中培養(yǎng)生長7d的幼苗。1.2實驗方法1.2.1DNA的提取DNA的提取采用CTAB法：取一棵幼苗，用剪刀剪碎后放在2.0mL的離心管中，加入液氮，研至粉狀即可，然后在離心管中加入60011L的裂解液，把離心管蓋好放在65°C的水浴鍋里預熱30min,期間要每隔lOmin反復顛倒幾次。預熱后加入氯仿：異戊醇抽提液600pL,把離心管蓋好放入低溫髙速冷凍離心機中以13000r/min離心15?20min,然后把上清液轉移到1.5mL的離心管中，加入1/10體積的醋酸鈉和2倍體積的無水乙醇，再放入離
6、心機中以13000r/min離心5min,倒出上清液，這時在底部就可以看到白色透明沉淀。再加入500uL的70%乙醇，離心2min,開蓋后將底部白色沉淀風干即可，加入100yL的TE緩沖溶液，-2（rc保存?zhèn)溆谩?.2.2PCR反應PCR反應體系為:10XBuffer倍液，dNTP0.12mmol/L,Mg2+1.5mmol/L,每種引物1Umol/L,0.2單位Taq酶，10ng的DNA,不足10uL的部分用超純水補足（共計10uL）oPCR反應程序為：95°C預變性5min,然后94°Clmin,56°C30s,72°C30s,進行35個
7、循環(huán)，再在72°C延伸7mino最后冷卻至re。1.2.3聚丙烯酰胺凝膠電泳把電泳槽裝好后在底部用1%的瓊脂凝膠封底，用聚丙烯酰胺凝膠溶液（8%的聚丙烯酰胺溶液+0.5%體積的10%過硫酸鐵溶液+0.1%的TEMED）灌膠,快速插入梳子。在PCR擴增反應產物中加入澳酚藍指示劑，待膠凝固后進行點樣。按正負極接通電泳儀后，180?200V的電壓下跑電泳2.5h左右。將膠放入固定液（體積比0.5%乙酸和體積比10%的乙醇）中固定12min,然后倒去固定液,用染色液（AgN03溶液）染色12min,倒去染色液，用純水漂洗2次，每次1?2mino最后將
8、凝膠放入顯色液（體積比0.4%的甲醛溶液和質量體積比1.5%的NaOH溶液）中直至條帶出現(xiàn)，并拍照記錄。2結果與分析齊兩優(yōu)918及其親本用48對引物進行篩（下轉12
