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1、胸膜肺炎放線桿菌毒素蛋白的克隆表達(dá)及多重?zé)晒釶OR診斷方法的研究中文摘要豬傳染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)是由胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種豬的高度接觸性傳染病，針對(duì)胸膜肺炎放線桿菌血清型眾多，．現(xiàn)有疫苗缺乏交叉保護(hù)力，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失的現(xiàn)狀，研究開發(fā)具有交叉保護(hù)力的新型疫苗迫在眉睫。研究發(fā)現(xiàn)Apx毒素是APP的主要保護(hù)性抗原，可提高疫苗滅活疫苗的保護(hù)作用。天然毒素提取產(chǎn)量低、過程繁
2、瑣且成本較高，利用體外克隆表達(dá)編碼Apx毒素結(jié)構(gòu)蛋白的基因，獲得的重組蛋白與天然提取的毒素免疫原性無明顯差異，可為下一步新型疫苗多肽成分和ELISA診斷抗原的研究做充分準(zhǔn)備。ApxlV是近年新發(fā)現(xiàn)的一個(gè)具有APP種屬特異性的抗原，只存在于自然感染的動(dòng)物體內(nèi)，不會(huì)與其它放線桿菌和革蘭氏陰性桿菌發(fā)生交叉反應(yīng)。編碼ApxlV毒素結(jié)構(gòu)蛋白的apxlVA基因C端特異性和保守性均很強(qiáng)，是首選的診斷抗原和靶基因。本研究運(yùn)用蛋白質(zhì)軟件Anthe5．0分析了APP的兩個(gè)關(guān)鍵毒力因子ApxIA和ApxlIA的抗原性和親水性，截取其中主要抗原
3、位點(diǎn)相對(duì)集中的核心區(qū)域，分別從胸膜肺炎放線桿菌血清l型國內(nèi)參考株259和血清7型國內(nèi)參考株265中擴(kuò)增了apxlA和apxlIA毒素基因，進(jìn)行體外克隆，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX．4T-1／apxlA和pET32a／apxlIA以及真核表達(dá)載體pPICZaA／apxlA；并用T4連接酶串連apxlA和apxlIA基因，構(gòu)建了該融合基因的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1／apxlA．a(chǎn)pxlIA；從胸膜肺炎放線桿菌血清l型國內(nèi)參考株259中擴(kuò)增apxlVA毒素C端特異和保守的一段基因，進(jìn)行體外克隆，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX
4、．4T-1／apxlVA。H以上四個(gè)原核表達(dá)載體分別在大腸桿菌DH5a、BL21和ToplO’F中以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，ApxIA、hpxUi、ApxIA-ApxIIA及ApxIVA在大腸桿菌中均以包涵體形式表達(dá)，表達(dá)的重組融合蛋白分別占菌體總蛋白的32％、23％、19％和40％，利用溶菌酶和超聲波對(duì)重組菌進(jìn)行分次裂解，除去大部分可溶的菌體蛋白，再用GlutathioneSepharose4B或Ni-NTA對(duì)相應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行進(jìn)一步過柱純化，最終獲得的重組融合蛋白純度在92％--,98％之間，Western-blot的結(jié)果表
5、明以上蛋自均具有良好的反應(yīng)原性，可直接用于ELISA診斷抗原或新型疫苗多肽成分的研究口ApxIA的真核表達(dá)載體經(jīng)甲醇誘導(dǎo)，在畢赤酵母GSll5中以低水平分泌表達(dá)至培養(yǎng)液上清，經(jīng)40倍濃縮才能檢測(cè)到目的蛋白，同時(shí)從重組酵母總RNA中檢測(cè)到apxlA基因的mRNA，可以證實(shí)目的基因發(fā)生了轉(zhuǎn)錄。經(jīng)分析，造成apxlA基因在畢赤酵母系統(tǒng)中低水平表達(dá)的原因可能是：一、組成目的基因的密碼子對(duì)于畢赤酵母的偏好指數(shù)極低；二、大量的酵母稀有密碼子使得臣的基因中tRNA豐度較低，導(dǎo)致翻譯過程出現(xiàn)瓶頸效應(yīng)；三、目的基因的高AT含量使酵母表達(dá)的
6、轉(zhuǎn)錄提前終止。豬傳染性胸膜肺炎和豬圓環(huán)病毒Ⅱ型在臨床上共感染較為普遍，都以侵害呼吸系統(tǒng)為主，根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌apxlVA基因和豬圓環(huán)病毒I至型ORF2基因中最特異最保守的片段分別設(shè)計(jì)引物和熒光標(biāo)記TaqMan探針，建立了可同時(shí)鑒別診斷豬傳染性胸膜肺炎和豬圓巧病毒玨型的實(shí)時(shí)定量熒光PCR方法，與其它經(jīng)常發(fā)生混合感染的豬繁殖呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)、豬瘟病毒(HCV)、偽狂犬病毒(PRV)、副豬嗜血桿菌(母)、多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌、鏈球菌等病原體均無交叉反應(yīng)。該方法用于檢測(cè)APP和PCV2DNA的敏感度分別達(dá)
7、到lxl01拷貝和1xlOo拷貝，并且在兩種病原的模板濃度相差105個(gè)拷貝時(shí)仍可以同時(shí)被檢出。建立了APP和PCV2兩種單重的TaqMan探針熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法。所建立的診斷方法快速便捷、特異性好、敏感度高，對(duì)早期的快速診斷和篩查以及I!I病原的凈化具有很高的實(shí)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：胸膜肺炎放線桿菌；Apx毒素；表達(dá)：圓環(huán)病毒；熒光PCRIVCLoNlNGANDEXPRESSING0FAPX0FAC譬INoBAC王LLUSPLEUROPNEUMoN薹AEANDSTUDYoFMUIJIPLEXREAL．TIMEPCRAB
8、STRACTPorcinecontagiouspleuropneumoniaisaseriouscontactedinfectiousdiseaseofporcinecausedbyActinobacilluspleuropneumoniaewhichownsmultitudeserotype．Basedonthed
