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《金黃色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、摘要金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(chemotaxjs1nhibitoryProtejnof＆印垣Pf?！辌c砒口駢塒，cHIPs)是由金黃色葡萄球菌分泌到菌體外的一種蛋白，能特異性地與中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞上的c5a受體(c5aR)和fMLP受體(FPR)結(jié)合，從而阻止細(xì)胞的趨化作用。但是，可否將CHlPs作為藥物來(lái)治療由c5a或日訂LP誘發(fā)的炎癥性疾病或?qū)HIPs作為免疫原來(lái)防制金黃色葡萄球菌感染，目前尚不清楚。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)合成了一對(duì)PCR擴(kuò)增特異性引物，分別從金黃色葡萄球Newman株和cowallI株中擴(kuò)增獲得了cHIPs基因，進(jìn)一步將其克隆到pMDl8-T載體獲得
2、重組質(zhì)粒pMD-N和pMD-c。并對(duì)其進(jìn)行測(cè)序分析。結(jié)果，與GenB“k中提供的cHlPs基因序列相比，Newman株具有100％的同源性，cowan】株只有一個(gè)堿基突變R298A—G：二者氨基酸同源性均為100％。說(shuō)明cHIPs基因高度保守。將pMD-N，pMD-c質(zhì)粒和pEl’32a(+)表達(dá)載體進(jìn)行勘mH】和曲¨雙酶切，回收cHlPs基因片段，將其插入到pET32a(+)原核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化到B02l(DE3)EcDff，經(jīng)篩選分別獲得pET-N仍E3和pET-c艦3重組體細(xì)菌。經(jīng)1P1B誘導(dǎo)表達(dá)和sDs．PAGE分析，結(jié)果與對(duì)照菌株相比，誘導(dǎo)后的pE]：N仍E3和
3、pET-c／DE3表達(dá)約為31．8kDa的融合蛋白，且表達(dá)蛋白存在于菌體超聲波裂解上清中；進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行westem_blotting分析證實(shí)，表達(dá)的融合蛋白為目的蛋白。說(shuō)明本試驗(yàn)cHIPs得到了良好表達(dá)，且為可溶性蛋白。用MagneHisT”蛋白純化系統(tǒng)對(duì)表達(dá)的CHPs蛋白進(jìn)行純化，并將純化后的cHIPs蛋白用于人工刨傷感染韻動(dòng)物模型試驗(yàn)，結(jié)果與對(duì)照組相比，使用cHDs蛋白組對(duì)創(chuàng)傷感染愈合具有明顯的延遲作用，表明cHIPs蛋白對(duì)炎癥具有抑制或延緩作用。關(guān)鍵訶：趨化抑制蛋白，基因克隆，原核表達(dá)，c5a受體。fMLP受體Abstractchemotaxisinhjbito
4、ryprotejnof所珈，∞D(zhuǎn)cc淞口“M珊(cHIPs)isakindofproteinthatexcretedbyS口ⅣrP淞．CHlPscanspec雨callybindtoc5areceptor(C5aR)a11dtheforInylatedpeptidereceptor(FPR)existingonthesurfaceofneutrophils枷dmonoc”es，therebyb】ockchemotaxjsofneutrophjlsandmonocytesmediatedbyC5aandfonnylatedpeptides，respectiVely．But
5、，itis1essknownuptonowthatwhemerCHIPScallbeusedaSacandidatedmgfor廿10seinn啪matorydiseasesinducedbyC5aandforInylatedpeptidesaIld／0rana11tigenforpmV0kingimmuneresponseagainst&口we螂infectjon．1nthjs『epon，thegenesofcHIPs如m＆dm℃淞Newmanandcow柚lstrainswere鋤plifiedbyPCRwithapairofprimerSandsuccessfIl
6、llyintroducedrespectjVelyjntopMDl8-Tvectors．1’worecombinalltclones，pMD-NandpMD-C，can了ingtlleCHIPSgeneofNe砌aIla11dCowallIstrainwereob詛inedandsequenced．ThenucleotidesequenceOf也eCHlPSgene‰NewmanstrainhadlOO％hom0109ytomesequencepublishedpreviouslyinGenB卸k鋤dthat療DmCowan1strainhadonlyonemu協(xié)tio
7、n(R299A_÷G)comparedw曲廿lesequencepublislledpreviouslyinGenBank．Thededuced啪inoacidsequencesofllleCHIPSf而mNewmaIla11dCowaIl1s打ajnwere100％homologytothesequencepublishedpreviously．ThoSesu鵲estedthatt11eCHIPSgenewashigh】yconserva石Ve．Thep∞_N，pMDcp1踟idandthepET32a(+)ex孵sionVec瞬weT
