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《金黃色葡萄球菌CHIPS基因克隆及原核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、摘要金黃色葡萄球菌趨化抑制蛋白(chemotaxjs1nhibitoryProtejnof＆印垣Pf?！辌c砒口駢塒，cHIPs)是由金黃色葡萄球菌分泌到菌體外的一種蛋白，能特異性地與中性粒細胞和單核細胞上的c5a受體(c5aR)和fMLP受體(FPR)結合，從而阻止細胞的趨化作用。但是，可否將CHlPs作為藥物來治療由c5a或日訂LP誘發(fā)的炎癥性疾病或將cHIPs作為免疫原來防制金黃色葡萄球菌感染，目前尚不清楚。本試驗設計合成了一對PCR擴增特異性引物，分別從金黃色葡萄球Newman株和cowallI株中擴增獲得了cHIPs基因，進一步將其克隆到pMDl8-T載體獲得
2、重組質粒pMD-N和pMD-c。并對其進行測序分析。結果，與GenB“k中提供的cHlPs基因序列相比，Newman株具有100％的同源性，cowan】株只有一個堿基突變R298A—G：二者氨基酸同源性均為100％。說明cHIPs基因高度保守。將pMD-N，pMD-c質粒和pEl’32a(+)表達載體進行勘mH】和曲¨雙酶切，回收cHlPs基因片段，將其插入到pET32a(+)原核表達載體并轉化到B02l(DE3)EcDff，經篩選分別獲得pET-N仍E3和pET-c艦3重組體細菌。經1P1B誘導表達和sDs．PAGE分析，結果與對照菌株相比，誘導后的pE]：N仍E3和
3、pET-c／DE3表達約為31．8kDa的融合蛋白，且表達蛋白存在于菌體超聲波裂解上清中；進一步對其進行westem_blotting分析證實，表達的融合蛋白為目的蛋白。說明本試驗cHIPs得到了良好表達，且為可溶性蛋白。用MagneHisT”蛋白純化系統(tǒng)對表達的CHPs蛋白進行純化，并將純化后的cHIPs蛋白用于人工刨傷感染韻動物模型試驗，結果與對照組相比，使用cHDs蛋白組對創(chuàng)傷感染愈合具有明顯的延遲作用，表明cHIPs蛋白對炎癥具有抑制或延緩作用。關鍵訶：趨化抑制蛋白，基因克隆，原核表達，c5a受體。fMLP受體Abstractchemotaxisinhjbito
4、ryprotejnof所珈，∞Dcc淞口“M珊(cHIPs)isakindofproteinthatexcretedbyS口ⅣrP淞．CHlPscanspec雨callybindtoc5areceptor(C5aR)a11dtheforInylatedpeptidereceptor(FPR)existingonthesurfaceofneutrophils枷dmonoc”es，therebyb】ockchemotaxjsofneutrophjlsandmonocytesmediatedbyC5aandfonnylatedpeptides，respectiVely．But
5、，itis1essknownuptonowthatwhemerCHIPScallbeusedaSacandidatedmgfor廿10seinn啪matorydiseasesinducedbyC5aandforInylatedpeptidesaIld／0rana11tigenforpmV0kingimmuneresponseagainst&口we螂infectjon．1nthjs『epon，thegenesofcHIPs如m＆dm℃淞Newmanandcow柚lstrainswere鋤plifiedbyPCRwithapairofprimerSandsuccessfIl
6、llyintroducedrespectjVelyjntopMDl8-Tvectors．1’worecombinalltclones，pMD-NandpMD-C，can了ingtlleCHIPSgeneofNe砌aIla11dCowallIstrainwereob詛inedandsequenced．ThenucleotidesequenceOf也eCHlPSgene‰NewmanstrainhadlOO％hom0109ytomesequencepublishedpreviouslyinGenB卸k鋤dthat療DmCowan1strainhadonlyonemu協(xié)tio
7、n(R299A_÷G)comparedw曲廿lesequencepublislledpreviouslyinGenBank．Thededuced啪inoacidsequencesofllleCHIPSf而mNewmaIla11dCowaIl1s打ajnwere100％homologytothesequencepublishedpreviously．ThoSesu鵲estedthatt11eCHIPSgenewashigh】yconserva石Ve．Thep∞_N，pMDcp1踟idandthepET32a(+)ex孵sionVec瞬weT
