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《大鼠肝細胞分離和原代培養(yǎng)的簡易方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、222江蘇農業(yè)學報(JiangsuJ.ofAgr.Sci.),2009,25(1):222～224大鼠肝細胞分離和原代培養(yǎng)的簡易方法劉學忠,李慧敏,王富民,顧建紅,劉宗平(揚州大學獸醫(yī)學院,江蘇揚州225009)關鍵詞:大鼠;肝細胞;分離;原代培養(yǎng);鑒定中圖分類號:Q2233文獻標識碼:A文章編號:100024440(2009)0120222203ASimplifiedMethodforSeparationandPrimaryCultureofRatHepatocytesLIUXue2zhong
2、,LIHui2min,WANGFu2min,GUJian2hong,LIUZong2ping(CollegeofVeterinaryMedicine,YangzhouUniversity,Yangzhou225009,China)Keywords:rat;hepatocyte;isolation;primaryculture;identification體外分離培養(yǎng)肝細胞是人工肝、毒理學、藥理學、生理學113鼠尾膠原制備及培養(yǎng)板包被以及基因工程等研究的基礎,良好的分離技術是獲取高活性11311鼠
3、尾膠原制備取SD大鼠1只,剪斷鼠尾,置75%[1]肝細胞的前提。長期以來,國內外普遍采用Seglen的膠原乙醇中浸泡30min,于無菌條件下將鼠尾切成115cm左右酶原位兩步灌流法,該法成為分離肝細胞的經典方法,在此的小段,剝去皮毛,抽出尾腱置于平皿中,剪碎以后浸入150[2]基礎上又發(fā)展了半原位酶分離技術。但該類方法仍存在ml011%醋酸溶液中,4℃冰箱中放置48h,并不時振蕩。操作繁瑣、流程長、膠原酶耗費大等問題。本研究擬采用胰4000r/min離心30min,吸取上清,經67155kP(1
4、1516℃)酶、膠原酶兩步消化法獲取肝細胞,以求操作簡便,膠原酶用高壓滅菌10min后分裝,-20℃保存?zhèn)溆?。量?并能滿足一般實驗室對肝細胞的要求。11312培養(yǎng)板包被取少許膠原加到培養(yǎng)板中,不宜太厚,放到高壓過的鋁盒中,通入氨氣作用15min取出培養(yǎng)板,用1材料與方法無菌生理鹽水沖洗,置紫外燈下過夜。111試驗動物114大鼠肝細胞分離及培養(yǎng)出生3d的SD大鼠(揚州大學實驗動物中心提供)。11411肝細胞分離出生3d的SD大鼠斷頭處死放入112主要試劑及儀器75%乙醇中消毒10min,無菌條件
5、下取肝臟,置冰冷PBS中,鼠尾膠原(自制);DMEM培養(yǎng)基(Gibco);胎牛血清(杭撕去肝包膜,剪碎后先加入0105%的胰酶,37℃振蕩消化20州四季青);胰酶(上海生工,1∶250);IV型膠原酶(Worthing2min,棄去上清后再用0105%的IV型膠原酶37℃振蕩消化ton,280U/mg);堿性品紅、偏重亞硫酸鈉、過碘酸(上海生20min,分別用120目、200目網篩過濾,細胞懸液在4℃條工);二氧化碳培養(yǎng)箱(Healforce);高速冷凍離心機(Jouan/件下800r/min離
6、心3min,反復離心3次。沉積的細胞用含5MR23i)、倒置顯微鏡(重慶光學儀器廠);XL302ESEM環(huán)境10%胎牛血清的DMEM調整細胞密度為1ml5×10個細掃描電子顯微鏡(Philips)。胞,臺盼藍染色測定肝細胞活力。11412肝細胞原代培養(yǎng)調整好密度的細胞接種在膠原包被的培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24h后換液,去掉紅細胞。收稿日期:2008206211115過碘酸2雪夫反應鑒定肝細胞基金項目:國家自然科學基金項目(30440050、305713647)11511高碘酸氧化液配制015g高碘酸溶于
7、100ml蒸餾作者簡介:劉學忠(19682),男,江蘇江都人,博士研究生,主要從事動物營養(yǎng)代謝病與中毒病學研究。(Tel)0514287979042;水中,4℃冰箱保存。(E2mail)xmnkliu@yahoo1com1cn11512Schiff劑配制1g堿性品紅溶于200ml煮沸的蒸餾通訊作者:劉宗平,(Tel)0514287991448;(E2mail)Liuzongping@yzu1edu1cn水中,振蕩5min,冷卻至50℃過濾,并向濾液中加20ml1劉學忠等:大鼠肝細胞分離和原代培養(yǎng)
8、的簡易方法223mol/L的鹽酸。冷至25℃時加1g焦亞硫酸鈉(Na2S2O5)。將此液置暗處12～24h,加2g活性碳,搖動1min過濾,保存于0～4℃,用時恢復室溫。11513PAS糖原染色取出肝細胞爬片,用019%的生理鹽水清洗2次,每次3min,70%酒精固定10min,高碘酸水溶液反應10min,流水沖洗,蒸餾水洗5min,曬干,置入Schiff試劑中10～30min后水洗3min,自然干燥后鏡下觀察。116肝細胞形態(tài)學觀察試驗過程中用相差倒置顯微鏡對分離純化和接種的肝細胞進行形態(tài)學觀
