資源描述：
《細胞凋亡實驗步驟及注意事項》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、細胞凋亡實驗步驟及注意事項一、實驗?zāi)康?、掌屋凋亡細胞的形態(tài)特征 2、學(xué)會用熒光探針對細胞進行雙標記來檢測正?；罴毎?、凋亡細胞和壞死細胞的方法二、實驗原理細胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張、細胞核固縮破裂呈團塊狀或新月狀分布、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細胞膜進一步融合將
2、細胞分成多個完整包裹的凋亡小體，凋亡小體最后被吞噬細胞吞噬消化。在凋亡過程中細胞內(nèi)容物并不釋放到細胞外，不會影響其它細胞，因而不引起炎癥反應(yīng)。在生物化學(xué)上，多數(shù)細胞凋亡的過程中，內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶活化，活性增加。核DNA隨機地在核小體的連接部位被酶切斷，降解為180-200bp或它的整倍數(shù)的各種片斷。如果對核DNA進行瓊脂糖電泳，可顯示以180-200bp為基數(shù)的DNAladder（梯狀帶紋）的特征。相比之下，壞死是細胞處于劇烈損傷條件下發(fā)生的細胞死亡。細胞在壞死早期即喪失質(zhì)膜完整性，各種細胞器膨脹，進而質(zhì)膜崩解釋放出其中的內(nèi)容物，引起炎癥反應(yīng)，壞死過程中細胞核DN
3、A雖也降解，但由于存在各種長度不等的DNA片斷，不能形成梯狀帶紋，而呈彌散狀。一些溫和的損傷刺激及一些抗腫瘤藥物可誘導(dǎo)細胞凋亡，通常這些因素在誘導(dǎo)凋亡的同時，也可產(chǎn)生細胞壞死，這取決于損傷的劇烈程度和細胞本身對刺激的敏感程度。三尖杉酯堿（HT）是我國自行研制的一種對急性粒細胞白血病，急性單核白血病等有良好療效的抗腫瘤藥物。研究表明HT在0.02~5μg/ml范圍內(nèi)作用2小時，即可誘導(dǎo)HL-60細胞凋亡，并表現(xiàn)出典型的凋亡特征。本實驗用1μg/mlHT在體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的HL-60細胞發(fā)生凋亡，同時也有少數(shù)細胞發(fā)生壞死。用Hoechst33342和碘化丙啶（propid
4、iumiodide，PI）對細胞進行雙重染色，可以區(qū)別凋亡、壞死及正常細胞。細胞膜是一選擇性的生物膜，一般的生物染料如PI等不能穿過質(zhì)膜。當(dāng)細胞壞死時，質(zhì)膜不完整，PI就進入細胞內(nèi)部，它可嵌入到DNA或RNA中，使壞死細胞著色，凋亡細胞和活細胞不著色。而一些活細胞染料由于為親脂性物質(zhì)，可跨膜進入活細胞，因而可進行活細胞染色。Hoechst33342是一種活性熒光染料且毒性較弱，它是雙苯并咪唑的一種衍生物。與DNA特異結(jié)合（主要結(jié)合于A-T）堿基區(qū)），顯示凋亡細胞和活細胞。凡是看到有凋亡小體的細胞都是凋亡細胞。三、實驗用品1、試劑：三尖杉酯堿（HT），300μg/m
5、l，100mmol/LTris-HCl（pH7.5），5mol/LEDTA緩沖液、堿性裂解液：0.2mol/LNaOH,1%SDS、醋酸鈉：3mol/LKAc（pH4.8）；異丙醇；70%乙醇；溴酚藍，蔗糖指示劑。TBE電泳緩沖液，1%瓊脂糖，溴乙錠。PI母液：500μg/ml；Ho33342母液：2mmol/L?！ ?、儀器設(shè)備：熒光顯微鏡，電泳儀，電泳槽，微量加樣器（1ml，100μl）0.5、1.5ml離心管，載玻片，蓋玻片。四、實驗材料人早幼粒白血病HL-60細胞，用含10%小牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)。五、方法步驟1、三
6、尖杉酯堿誘發(fā)HL-60細胞凋亡 ?。?）實驗前約24小時，接種兩瓶HL-60細胞，標記①、②，每瓶含約6ml培養(yǎng)液，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)?！ 。?）實驗前約2.5小時，當(dāng)細胞密度達到70%，①號瓶加入三尖杉酯堿200μl，使終濃度為1μg/ml，②號瓶中加入同等量PBS（pH7.4）作對照。共同放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2.5小時。2、Ho33342和PI雙重染色鑒別三種細胞 ?。?）染色：將瓶中的細胞搖勻取200μl于1.5ml的離心管中，加入Ho33342母液2μl，PI20μl，染色15分鐘?！ 。?）滴片：取一載玻片用雙面膠圍成一小室，從離心管中各取以
7、上染色后的細胞懸液10μl，加入小室內(nèi)蓋上蓋玻片，熒光鏡下用紫外激發(fā)光，高倍鏡下觀察，區(qū)別三種細胞，并注意三者比例。注意事項1.誘導(dǎo)培養(yǎng)HL-60細胞時間要準確；2.熒光顯微鏡下觀察細胞時，由于熒光易碎滅，觀察時要盡量快。其他細胞死亡根據(jù)其性質(zhì)、起源及生物學(xué)意義區(qū)分為凋亡和壞死兩種不同類型。凋亡普遍存在于生命界，在生物個體和生存中起著非常重要的作用。它是細胞在一定生理條件下一系列順序發(fā)生事件的組合，是細胞遵循一定規(guī)律自己結(jié)束生命的自主控制過程。細胞凋亡具有可鑒別的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征。在形態(tài)上可見凋亡細胞與周圍細胞脫離接觸，細胞變園，細胞膜向內(nèi)皺縮、胞漿濃縮、內(nèi)質(zhì)
8、網(wǎng)擴張、細
