tunel細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟

《tunel細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。

1、TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒內(nèi)容及操作步驟--------------------------------------------------------------------------------　凋亡細(xì)胞的原位末斷轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法（TUNEL法）細(xì)胞凋亡的多步驟機制作用的最終環(huán)節(jié)是；細(xì)胞內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的激活而導(dǎo)致核染色質(zhì)DNA雙鏈的斷裂。大量DNA片段暴露出的3羥基在末斷轉(zhuǎn)移酶(terminaldeoxynucleotidyltransferase,TdT)或DNA多聚酶的作用下，與生物素或地高辛標(biāo)記的核苷酸結(jié)合，最終借助與卵白素或抗地高辛抗體結(jié)合

2、的熒光素或HRP，使凋亡細(xì)胞被特異性地標(biāo)記和顯示出來。TUNEL細(xì)胞凋亡試劑盒由美國羅氏公司提供試劑1：酶濃縮溶液（EnzymeSolution）試劑2：標(biāo)記溶液（LableSolution）試劑3：轉(zhuǎn)化劑-POD（Converter-POD）酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型）試驗所需其它試劑：非石蠟切片:·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液（PBS）·阻斷溶液:0.3%H2O2甲醇溶液·固定溶液:4%多聚甲醛（溶劑pH7.4新鮮配制的PBS溶液）·滲透液:0.1%Triton甔-100（溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液）TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚

3、)名：曲拉通X-100，乳化劑OP分子式：C34H62O11石蠟切片:·二甲苯和乙醇（100%、95%、90%、80%、70%用蒸餾水稀釋）·沖洗緩沖液:磷酸鹽緩沖液（PBS）·蛋白酶K工作液10~20mg/ml溶于10mMTris/HCl（pH7.4~7.8）根據(jù)需要選擇:·滲透液:0.1%TritonX-100（溶于新鮮配制的0.1%枸櫞酸鈉溶液）·胃酶溶液（0.25%-0.5%溶于HCl，pH2）或胰酶·0.1M枸櫞酸緩沖液，pH6，微波修復(fù)材料：微波爐，微波輸出功率850W-2000W2.選用中性甲醇固定的活檢及實驗動物標(biāo)本，常規(guī)脫水，二甲苯

4、透明，石蠟包埋。操作步驟抗原微波修復(fù)（供參考）1.組織經(jīng)福爾馬林固定后會產(chǎn)生廣泛的蛋白質(zhì)交連，因此石蠟組織進(jìn)行凋亡檢測時要進(jìn)行預(yù)處理。經(jīng)我公司科研人員的長期研究認(rèn)為：TUNEL染色時蛋白酶K的作用有可能引起內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶的釋放，造成假陽性反應(yīng)，同時過量的蛋白酶K處理可破壞組織的結(jié)構(gòu)，用微波技術(shù)替代上述處理可避免上述弊端的出現(xiàn)。2.微波已被愈來愈多地作為免疫組織化學(xué)和原位雜交的預(yù)處理過程，經(jīng)一定溫度的微波處理可修復(fù)因固定和包埋造成的抗原破壞，打斷氨基酸的肽鍵結(jié)合，促進(jìn)抗原決定簇的暴露，恢復(fù)細(xì)胞膜的空間結(jié)構(gòu)，增加穿透效應(yīng)，加速組織處理及染色過程。我們在

5、作TUNEL染色前進(jìn)行微波修復(fù)，可以達(dá)到蛋白酶K的功效，取得較為理想的效果，背景染色很淺，凋亡細(xì)胞陽性顆粒與背景染色對比非常鮮明。3.蛋白酶K作用的條件嚴(yán)格，消化度常因組織的不同而在操作中不便掌握。同時蛋白酶K的價格昂貴，而微波已作為一種常用儀器用于免疫組織化學(xué)染色中。(1)切片常規(guī)脫蠟入水(2)將一燒杯盛200ml的0.01M、pH6.0的檸檬酸緩沖液，加熱至90～95℃，迅速放入切片，使用680W(80%功率)、微波照射1min，加入雙蒸水(20～25℃)80ml作迅速冷卻，將玻片移至PBS(20～25℃)。(3)PBS洗5min×3次。(4)加

6、20%正常牛血清室溫30min。(5)將TUNEL反應(yīng)混合液加在切片上，37℃溫育90min(陰性對照片、TUNEL混合液中不加TDT)。(6)PBS洗5min×3次。(7)3%H2O2甲醇液室溫阻斷10min。(8)37℃溫育90min。(9)加POD轉(zhuǎn)化劑，37℃溫育30min。(10)PBS洗5min×3次。(11)DAB/H2O2顯色。(12)蘇木素淡染，常規(guī)脫水，透明，中性樹膠封固。結(jié)果：細(xì)胞核呈棕色顆粒者為陽性細(xì)胞，結(jié)合形態(tài)特征，可確立凋亡細(xì)胞。陰性對照片無棕色顆粒。細(xì)胞凋亡的檢測技術(shù)簡介（供參考）一.凋亡細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變細(xì)胞表面：偽足,

7、微絨毛等消失細(xì)胞體形態(tài)：細(xì)胞皺縮，變形，體積變小細(xì)胞核：染色質(zhì)濃縮，早期染色質(zhì)聚集于核膜邊呈新月形或環(huán)形，晚期碎裂細(xì)胞器：密集但形態(tài)及結(jié)構(gòu)完整，早期內(nèi)質(zhì)網(wǎng)短暫擴張細(xì)胞膜:完好，晚期包裹細(xì)胞器或核碎片，形成凋亡小體在組織中表現(xiàn)：常常以單個細(xì)胞散在發(fā)生周圍組織反應(yīng)：凋亡細(xì)胞或小體被鄰近巨噬細(xì)胞，上皮細(xì)胞吞噬，降解，不發(fā)生炎癥反應(yīng)發(fā)生條件：屬于基因控制的程序性細(xì)胞死亡，多發(fā)生于器官萎縮，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫殺傷機制，小劑量毒素作用以及多種病理生理狀態(tài)二.細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測方法(一)凋亡細(xì)胞的光鏡和熒光顯微鏡檢測1.制片(1)常規(guī)組織學(xué)切片，進(jìn)行脫蠟和水化。(2

8、)培養(yǎng)細(xì)胞可用細(xì)胞離心儀制片。由于凋亡細(xì)胞在制片中容易破碎,所以應(yīng)采用低速離心制片(250g,離心5min)