分子腫瘤學(xué)基礎(chǔ)

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1、毒理學(xué)教研室徐德祥分子腫瘤學(xué)基礎(chǔ)第一章緒論腫瘤發(fā)病的流行病學(xué)現(xiàn)狀腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展腫瘤的分子診斷研究進(jìn)展一、腫瘤發(fā)病的流行病學(xué)現(xiàn)狀1、惡性腫瘤發(fā)病和死亡率明顯升高，成為人類死因的第一位（城市）或第二位（全國(guó)）；2、惡性腫瘤的發(fā)病順位發(fā)生了明顯的變化。生活方式改變環(huán)境改變二、腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展1、腫瘤的多因素多階段多基因參與的過程2、腫瘤的發(fā)病與體細(xì)胞突變有關(guān)3、信號(hào)傳導(dǎo)與腫瘤4、細(xì)胞周期與腫瘤5、細(xì)胞分化與腫瘤6、細(xì)胞凋亡與腫瘤7、腫瘤的遺傳易感性腫瘤的多因素多階段多基因參與的過程多因素多階段：二階段學(xué)說多階段學(xué)說多基因參與：癌基因、抑癌基因細(xì)胞凋亡相

2、關(guān)基因、腫瘤易感基因腫瘤的發(fā)病與體細(xì)胞突變有關(guān)癌基因：維持細(xì)胞正常生理功能所必須的基因細(xì)胞增殖、分化、信號(hào)轉(zhuǎn)到體細(xì)胞突變學(xué)說：腫瘤的發(fā)生與癌基因突變有關(guān)點(diǎn)突變、DNA擴(kuò)增染色體重排、甲基化抑癌基因：純合缺失或失活而引起惡性轉(zhuǎn)化的基因二次突變學(xué)說（Rb基因，視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤）遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤患者（Rb等位基因突變或缺失）：一次突變引起發(fā)病非遺傳性視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤：二次突變突變引起發(fā)病腫瘤易感性和易感基因腫瘤易感性：環(huán)境與遺傳腫瘤易感基因：癌基因和抑癌基因的突變DNA修復(fù)缺陷代謝酶基因：化學(xué)致癌三、腫瘤的分子診斷及其研究進(jìn)展1、分子診斷在腫瘤研究中的意義和應(yīng)用腫瘤

3、的分子診斷涉及到各種惡性腫瘤及癌前病變，主要集中在各種癌基因、抑癌基因及相關(guān)基因的檢測(cè)，分別在蛋白質(zhì)、RNA、DNA水平進(jìn)行判斷，為腫瘤的基礎(chǔ)研究、腫瘤防治和個(gè)體化或預(yù)見性治療提供更詳盡的證據(jù)。（1）腫瘤易感基因的檢測(cè)（2）腫瘤的分類對(duì)Bcr區(qū)基因重排檢測(cè)：可診斷慢粒并與急粒鑒別。神經(jīng)母細(xì)胞瘤——N-Myc明顯擴(kuò)增和過表達(dá)；神經(jīng)上皮瘤——c-Myc擴(kuò)增和過表達(dá)。（3）腫瘤的早期診斷（4）腫瘤的預(yù)后判斷：從分子水平上判斷腫瘤的良、惡性及預(yù)后，有較高的準(zhǔn)確性。腫瘤相關(guān)基因的突變、擴(kuò)增及過表達(dá)等常與預(yù)后密切相關(guān)。（5）腫瘤的個(gè)體化和預(yù)見性治療:腫瘤的發(fā)生是多基因、多

4、步驟、多階段的過程，在發(fā)生、發(fā)展的不同時(shí)期，可能涉及不同的基因和不同的變化形式，而基因的變化和基因間的信號(hào)傳遞與腫瘤臨床治療的敏感性密切相關(guān)。提供腫瘤基因變化，對(duì)治療有指導(dǎo)意義。（6）腫瘤的預(yù)后監(jiān)測(cè)2、腫瘤基因過表達(dá)及其檢測(cè)（1）基因過表達(dá)的形式癌基因激活和抑癌基因失活，是腫瘤發(fā)生過程中的關(guān)鍵因素。癌基因產(chǎn)物過表達(dá)是癌基因激活的重要表現(xiàn)形式之一。癌基因一般為單拷貝基因，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的一些癌基因在DNA復(fù)制過程中擴(kuò)增，常導(dǎo)致基因產(chǎn)物過表達(dá)，表現(xiàn)為mRNA和蛋白質(zhì)量增加。有些抑癌基因突變后可起到癌基因的作用（如p53基因），產(chǎn)生突變型蛋白。（2）基因過表達(dá)的檢測(cè)①

5、表達(dá)產(chǎn)物的檢測(cè)：幾乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有相應(yīng)抗體，其中大多數(shù)已商品化。免疫組化（immunohistochemistry）酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）免疫沉淀法：檢測(cè)并定量分析蛋白質(zhì)混合物中的靶抗原敏感（可檢出100pg的放射性標(biāo)記蛋白）。與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并用，可用于分析外源基因在原核和真核宿主細(xì)胞中的表達(dá)。蛋白印跡法（Westernblot）：70年代末80年代初，在蛋白質(zhì)凝膠電泳（分辨率高）和固相免疫測(cè)定（特異敏感）的基礎(chǔ)上發(fā)展的，結(jié)合了二者優(yōu)點(diǎn)，無(wú)需同位素標(biāo)記，具有從混雜抗原中檢出特定抗原，或從多克隆抗體中檢出單克隆抗體的優(yōu)勢(shì)，

6、還可對(duì)轉(zhuǎn)移到固相膜上的蛋白進(jìn)行連續(xù)分析，有蛋白質(zhì)反應(yīng)均一性、固相膜保存時(shí)間長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。敏感性為1～5ng。細(xì)胞裂解—→SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳→蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移→封閉→加一抗→加二抗→顯色照像。流式細(xì)胞儀（flowcytometry）測(cè)試法：用熒光標(biāo)記抗體與含有特異抗原的細(xì)胞結(jié)合，用流式細(xì)胞儀對(duì)含不同熒光信號(hào)的細(xì)胞分類測(cè)試，可檢測(cè)細(xì)胞表面受體、標(biāo)志物或特異性蛋白及細(xì)胞的分類分析。②基因擴(kuò)增的檢測(cè)：腫瘤基因擴(kuò)增可產(chǎn)生過量的表達(dá)蛋白，也可表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)增加和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA增加。經(jīng)典檢測(cè)方法為核酸分子雜交，包括原位雜交（insituhydridization，ISH

7、）、熒光原位雜交（FISH）、DNA雜交（Southernblot）、RNA雜交（Northernblot）、原位PCR、逆轉(zhuǎn)錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）。FISH將熒光素標(biāo)記克隆的DNA片段與染色體或細(xì)胞間期染色質(zhì)雜交，以測(cè)定特定的DNA片段是否有缺失或擴(kuò)增。原位PCR：結(jié)合了PCR與ISH技術(shù)優(yōu)點(diǎn)，在組織切片或細(xì)胞涂片上原位對(duì)特定DNA或RNA進(jìn)行擴(kuò)增，再用特異性探針作原位雜交檢測(cè)，以達(dá)到對(duì)靶核苷酸進(jìn)行定性、定位、定量分析。逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）用來擴(kuò)增從RNA分子中得到的一段特異序列。RNA首先被逆轉(zhuǎn)錄為

8、cDNA。用位于一段特異序列或一個(gè)基因