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1、毒理學教研室徐德祥分子腫瘤學基礎第一章緒論腫瘤發(fā)病的流行病學現(xiàn)狀腫瘤發(fā)病機制的研究進展腫瘤的分子診斷研究進展一、腫瘤發(fā)病的流行病學現(xiàn)狀1、惡性腫瘤發(fā)病和死亡率明顯升高，成為人類死因的第一位（城市）或第二位（全國）；2、惡性腫瘤的發(fā)病順位發(fā)生了明顯的變化。生活方式改變環(huán)境改變二、腫瘤發(fā)病機制的研究進展1、腫瘤的多因素多階段多基因參與的過程2、腫瘤的發(fā)病與體細胞突變有關3、信號傳導與腫瘤4、細胞周期與腫瘤5、細胞分化與腫瘤6、細胞凋亡與腫瘤7、腫瘤的遺傳易感性腫瘤的多因素多階段多基因參與的過程多因素多階段：二階段學說多階段學說多基因參與：癌基因、抑癌基因細胞凋亡相
2、關基因、腫瘤易感基因腫瘤的發(fā)病與體細胞突變有關癌基因：維持細胞正常生理功能所必須的基因細胞增殖、分化、信號轉到體細胞突變學說：腫瘤的發(fā)生與癌基因突變有關點突變、DNA擴增染色體重排、甲基化抑癌基因：純合缺失或失活而引起惡性轉化的基因二次突變學說（Rb基因，視網(wǎng)膜母細胞瘤）遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤患者（Rb等位基因突變或缺失）：一次突變引起發(fā)病非遺傳性視網(wǎng)膜母細胞瘤：二次突變突變引起發(fā)病腫瘤易感性和易感基因腫瘤易感性：環(huán)境與遺傳腫瘤易感基因：癌基因和抑癌基因的突變DNA修復缺陷代謝酶基因：化學致癌三、腫瘤的分子診斷及其研究進展1、分子診斷在腫瘤研究中的意義和應用腫瘤
3、的分子診斷涉及到各種惡性腫瘤及癌前病變，主要集中在各種癌基因、抑癌基因及相關基因的檢測，分別在蛋白質、RNA、DNA水平進行判斷，為腫瘤的基礎研究、腫瘤防治和個體化或預見性治療提供更詳盡的證據(jù)。（1）腫瘤易感基因的檢測（2）腫瘤的分類對Bcr區(qū)基因重排檢測：可診斷慢粒并與急粒鑒別。神經母細胞瘤——N-Myc明顯擴增和過表達；神經上皮瘤——c-Myc擴增和過表達。（3）腫瘤的早期診斷（4）腫瘤的預后判斷：從分子水平上判斷腫瘤的良、惡性及預后，有較高的準確性。腫瘤相關基因的突變、擴增及過表達等常與預后密切相關。（5）腫瘤的個體化和預見性治療:腫瘤的發(fā)生是多基因、多
4、步驟、多階段的過程，在發(fā)生、發(fā)展的不同時期，可能涉及不同的基因和不同的變化形式，而基因的變化和基因間的信號傳遞與腫瘤臨床治療的敏感性密切相關。提供腫瘤基因變化，對治療有指導意義。（6）腫瘤的預后監(jiān)測2、腫瘤基因過表達及其檢測（1）基因過表達的形式癌基因激活和抑癌基因失活，是腫瘤發(fā)生過程中的關鍵因素。癌基因產物過表達是癌基因激活的重要表現(xiàn)形式之一。癌基因一般為單拷貝基因，在腫瘤細胞內的一些癌基因在DNA復制過程中擴增，常導致基因產物過表達，表現(xiàn)為mRNA和蛋白質量增加。有些抑癌基因突變后可起到癌基因的作用（如p53基因），產生突變型蛋白。（2）基因過表達的檢測①
5、表達產物的檢測：幾乎所有被克隆的癌基因、抑癌基因都有相應抗體，其中大多數(shù)已商品化。免疫組化（immunohistochemistry）酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）免疫沉淀法：檢測并定量分析蛋白質混合物中的靶抗原敏感（可檢出100pg的放射性標記蛋白）。與SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳并用，可用于分析外源基因在原核和真核宿主細胞中的表達。蛋白印跡法（Westernblot）：70年代末80年代初，在蛋白質凝膠電泳（分辨率高）和固相免疫測定（特異敏感）的基礎上發(fā)展的，結合了二者優(yōu)點，無需同位素標記，具有從混雜抗原中檢出特定抗原，或從多克隆抗體中檢出單克隆抗體的優(yōu)勢，
6、還可對轉移到固相膜上的蛋白進行連續(xù)分析，有蛋白質反應均一性、固相膜保存時間長等優(yōu)點。敏感性為1～5ng。細胞裂解—→SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳→蛋白質電轉移→封閉→加一抗→加二抗→顯色照像。流式細胞儀（flowcytometry）測試法：用熒光標記抗體與含有特異抗原的細胞結合，用流式細胞儀對含不同熒光信號的細胞分類測試，可檢測細胞表面受體、標志物或特異性蛋白及細胞的分類分析。②基因擴增的檢測：腫瘤基因擴增可產生過量的表達蛋白，也可表現(xiàn)為基因拷貝數(shù)增加和轉錄產物mRNA增加。經典檢測方法為核酸分子雜交，包括原位雜交（insituhydridization，ISH
7、）、熒光原位雜交（FISH）、DNA雜交（Southernblot）、RNA雜交（Northernblot）、原位PCR、逆轉錄PCR（reversetranscriptionPCR，RT-PCR）。FISH將熒光素標記克隆的DNA片段與染色體或細胞間期染色質雜交，以測定特定的DNA片段是否有缺失或擴增。原位PCR：結合了PCR與ISH技術優(yōu)點，在組織切片或細胞涂片上原位對特定DNA或RNA進行擴增，再用特異性探針作原位雜交檢測，以達到對靶核苷酸進行定性、定位、定量分析。逆轉錄PCR（RT-PCR）用來擴增從RNA分子中得到的一段特異序列。RNA首先被逆轉錄為
8、cDNA。用位于一段特異序列或一個基因
