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1、H9亞型禽流感病毒單克隆抗體及膠體金試紙條的研制DevelopmentofmonoclonalantibodiesandacolloidalgoldteststripagainstH9subtypeavianinfluenzaviruses[本文受家禽病毒病基因工程疫苗創(chuàng)制(2011AAl0A209)和公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201003012)資助]研究生：任倩導(dǎo)師：彭大新教授陳素娟副教授劉秀梵教授揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院2014年6月任倩：H9亞型禽流感病毒單克隆抗體及膠體金試紙條的研制H9亞型禽流感病毒單克隆抗體及膠體金試
2、紙條的研制研究生：任倩導(dǎo)師：彭大新教授陳素娟副教授劉秀梵教授摘要禽流感(AvianInfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的一種禽類的傳染病，感染動物表現(xiàn)出從呼吸系統(tǒng)到全身敗血癥等多種癥狀。目前對養(yǎng)殖qp危害比較大的是H5和H9亞型禽流感。H9亞型禽流感病毒本身引起的死亡率較低，但能與其他病原混合感染易感動物，引起較高的死亡率，此外也有H9亞型禽流感病毒感染人的報道。目前主要采取疫苗免疫和嚴(yán)格的生物安全措施來控制該病。鑒于H9亞型禽流感病毒對養(yǎng)禽業(yè)的危害及其在公共衛(wèi)生學(xué)上的意義，加強(qiáng)對此亞型病毒的檢測和疫病的防控迫在眉
3、睫。本研究選取了H9N2亞型禽流感病毒兩個主要分支的代表株F98和TX病毒，制備了單克隆抗體。在此基礎(chǔ)上，我們研制了用來檢測H9亞型禽流感病毒的膠體金試紙條。l針對H9N2亞型禽流感病毒單克隆抗體的制備選擇H9N2亞型禽流感病毒的兩個主要分支代表株F98病毒(F98．1ike)、TX病毒(Y280系)。病毒經(jīng)差速離心法純化后免疫6．8周齡Balb／c母鼠，通過傳統(tǒng)ELISA方法結(jié)合血凝抑制法篩選陽性克隆，最終得到13株能穩(wěn)定分泌抗體的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株，6株來自于F98病毒，分別命名為586、5Bl1、3F9、2F7、3
4、E6、5D3，抗體亞類分別為IgG2b、lgGl、IgGl、IgG2b、IgG2a、IgGl。7株來自于TX病毒，分別命名為1D5、6E5、5D8、383、1C9、181l、187，抗體亞類分別為lgG2a、IgG2b、lgG2a、IgGl、IgG2a、lgG2b、lgGl。特異性結(jié)果顯示，這13株腹水與Hl、H5、NDV和IBV都不反應(yīng)。Western．blot結(jié)果顯示，源于F98的單抗5811、586、3F9、3E6、5D3與F98反應(yīng)，源于TX的單抗1D5、5D8、383與TX反應(yīng)，均在50kDa左右出現(xiàn)一條特異性條帶
5、。間接免疫熒光實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)98的6株單抗對F98病毒均有特異性熒光，Tx的7株單抗除ID5、IBl1外，其余對TX病毒均有特異性熒光?！?1和試驗表明，單抗3E6、5D3、2F7、3F9、383和1C9揚州大學(xué)碩士論文2對母本病毒具有中和效價，為1018一1047。交叉血凝抑制試驗結(jié)果顯示，5D3和2F7有廣譜的血凝抑制作用。2檢測H9亞型流感病毒膠體金試紙條的研制通過檸檬酸三鈉還原方法制備膠體金，試紙條采用雙抗體夾心原理，將2F7單抗標(biāo)記的膠體金．抗體復(fù)合物以l：l5稀釋度包被于金標(biāo)墊上：將羊抗鼠IgG以1．5mg／m
6、L的濃度包被于NC膜的質(zhì)控線，5D3單抗以Img／mL的濃度包被于檢測線。當(dāng)檢測樣品中含有H9亞型病毒時兩條線均顯色，而不含有H9亞型病毒時就只有質(zhì)控線顯色。特異性實驗表明，試紙條口J^檢測H9亞型病毒，與其它亞型禽流感病毒及其它禽類病毒均沒有交叉反應(yīng)。廣譜性檢測表明，除NTTZC和G1一like亞系外，此試紙條可與所檢測的H9亞型病毒均反應(yīng)。用H9病毒尿囊液作為檢測原時，膠體金試紙條的最低檢測限為105EID50的病毒量，其敏感性約為血凝試驗的1．5倍。關(guān)鍵詞：禽流感病毒；H9N2亞型；單克隆抗體；膠體金試紙條任倩：It9
7、亞型禽流感病毒單克隆抗體及膠體金試紙條的研制DevelopmentofmonoclonalantibodiesandacolloidalgoldteststripagainstH9subtypeavianinfluenzavirusesM．S．can．didate：QianRenAdvisor：ProfiDaxinPengAssociateProfiSujuanChenProf．XiufanLiuAbstractAvianInfluenza(AI)isaninfectiousdiseasecausedbytypeAinflu
8、enzavirusofOrthomyxoviruseswithavarietyofsymptomsfromrespiratorysyptomtosystemicsepticemia，inwhichH5andH9subtypeofAIisthemostimportantdiseasetopo
