氨海水與5-羥色胺對櫛孔扇貝解剖卵的體外促熟作用.pdf

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1、第41卷第4期2011年4月中國海洋大學學報PERI()DICAL0F0CEANUNIVERSITY0FCHINA41(4)：046～050Apr．。2011氨海水與5一羥色胺對櫛孔扇貝解剖卵的體外促熟作用。邸煒鵬，王昭萍“，于瑞海，周珊珊，顧玲玲，李寧(中國海洋大學海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東青島266003)摘要：研究氨海水與5一羥色胺(5-HT)對櫛孔扇貝解剖獲得卵母細胞的促熟作用。通過體外浸泡的方法處理櫛孔扇貝卵母細胞使其成熟，并完成人工受精。結果表明一定濃度的氨海水可顯著促使櫛孔扇貝卵母細胞生發(fā)泡破裂，但

2、經(jīng)過氨處理的卵母細胞受精率卻不高；5-羥色胺不能誘導櫛孔扇貝卵母細胞生發(fā)泡破裂，但可有效地使已經(jīng)發(fā)生生發(fā)泡破裂的卵母細胞進一步成熟。先用氨海水處理然后用5一羥色胺處理可以得到最佳誘導效果，受精率可達(40．02士2．73)％。關鍵詞：櫛孔扇貝；體外成熟；氨海水；5-羥色胺中圖法分類號：s961．2+2文獻標志碼：A文章編號：1672—5174(2011)04-046—05雙殼貝類的繁育過程中，常采用解剖取卵、人工授精的方法，以避免精液過多的現(xiàn)象[1]。然而，貝類的卵子多是分批成熟分批產(chǎn)出的，解剖獲得的卵子存在成熟度不

3、夠及發(fā)育不同步現(xiàn)象，對其進行體外促熟是必要的。目前關于貝類解剖卵的體外促熟研究報道不多，僅見于太平洋牡蠣(Crassostreagigas)[2]、馬氏珠母貝(Pinctadamartensii)[3

4、、紫扇貝(Argopectenpurpu—ratus)[引、硬殼蛤(Mercenariamercenaria)[5I、浪蛤(Spisula)[6]等幾種貝類中。已有的研究結果表明海水浸泡、維生素、氨海水(AmmoniaSeawater，AS)、5一羥色胺(5一HT)、組胺等對貝類的解剖卵都有一定的促熟作用。櫛孔扇貝(C

5、hlamysfar理一)是我國北方重要的養(yǎng)殖貝類，因其解剖卵無法完成受精作用，卵子都是通過自然產(chǎn)出或誘導排放的途徑獲得，迄今未有其解剖取卵、體外促熟的報道。本研究采用氨海水和5一羥色胺(5一HT)對櫛孔扇貝的解剖卵進行體外促熟研究，通過對生發(fā)泡破裂(GerminalVesicleBreakdown，GVBD)情況和受精情況的分析來衡量2種試劑的促熟作用，探索扇貝解剖取卵、人工受精的可行性，最后通過氨和5一羥色胺的雙因子處理建立了櫛孑L扇貝解剖獲卵的體外促熟技術，該技術將在櫛孔扇貝的繁殖和遺傳操作中得到應用，并且對于建

6、立相關類型貝類卵母細胞的體外促熟技術均有借鑒。1材料與方法1．1精卵的獲得實驗用櫛孔扇貝親貝為青島海區(qū)養(yǎng)殖的成熟2齡貝(殼長6．19cm4-0．5cm，殼寬2．24am±0．2cm，殼高6．65cm±0．6cm，體質量54．86g士3．5g)。親貝經(jīng)過暫養(yǎng)穩(wěn)定后，挑選發(fā)育良好的親貝，解剖獲得精卵[7]。將卵液用100目篩絹濾去較大組織塊后，再用500目篩絹去除組織液和微小雜質；精液用300目篩絹過濾，選用上層，并檢查精子活性。1．2卵母細胞的促熟室溫(20℃)-F，在幾支15mL試管中加入等量卵液，再加入等量不同濃度

7、的處理液，控制卵密度為500---1000個／mL，搖勻計時。氨海水單獨處理時，處理濃度梯度設定為：0．0025％、0．005％、0．01％、0．015％、0．020％和0．025％(以分析純氨水25％～26％為100％)。處理時間梯度為：15、30、45和60min。5一羥色胺單獨處理時，處理濃度梯度設定為：0．001、0．002、0．003和0．004mol／L。處理時間梯度為：15、30、45和60rain。聯(lián)合處理時，選取前面2組中較好的濃度加以混合，并根據(jù)情況特別添加了先用氨海水浸泡再用5一羥色胺浸泡的處理

8、組(T組)。處理時間同上。選用在正常海水中浸泡的卵母細胞作為對照，每次實驗設3個平行組。1．3人工授精取出處理完畢的卵液，用500目篩絹過濾，洗去處理液，加入5mL小瓶中，再滴入1～2滴活力旺盛的精子，搖勻。受精過程中盡量多晃動。1．4觀察記錄GVBD發(fā)生率、受精率·基金項目：國家自然科學基金項目(30771622)；國家高技術研究發(fā)展計劃項目(2006AAl0A401)資助收稿日期：2010—Ol一22；修訂日期：20lO一03—23作者簡介：邸煒鵬(1984一)，男，碩士生，主要從事貝類遺傳育種研究。E-mail

9、：diweipen905110@163．C0121··通訊作者：E-mail：zpwang(孕OUC．edu．cn醉蚌鵬，等氨海水々5羥乜胺Ⅳ櫛扎?、蠼舛缏寻咨左w外促熟作月受精2～3h后．取樣進行顯微拍照．照片用于計算GVBD笈‘l：率、受精率。GVBD發(fā)生率=發(fā)生GVBn的細胞數(shù)／細胞總數(shù)×100％；受精率一正常卵裂的細胞數(shù)，細胞總數(shù)×i00