綠色熒光蛋白gfp標(biāo)記方法.ppt

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1、纖維素降解菌X-3的GFP標(biāo)記gfp質(zhì)粒的提取試驗路線gfp質(zhì)粒+X-3感受態(tài)細(xì)胞X-3感受態(tài)細(xì)胞的制備電擊轉(zhuǎn)化X-3-gfp標(biāo)記菌經(jīng)過傳代培養(yǎng)驗證其穩(wěn)定性,同時檢測其相關(guān)理化特性(ph,溫度,含氧量,轉(zhuǎn)速等)是否受到影響,確定gfp標(biāo)記的細(xì)菌可以用于進(jìn)一步研究GFP標(biāo)記菌落觀察油鏡觀察本實驗所需的的材料1.LB培養(yǎng)基:蛋白胨10g,NaCl10g,酵母浸膏5g,蒸餾水1000ml,pH7.02.抗生素壯觀霉素(SpectinomycineSpe)購自Sigma公司3.PEB洗滌液:蔗糖93.1g,MgCl20.2g,KH2PO40.953g,H2O1000ml

2、,pH7.43.電轉(zhuǎn)儀:伯樂MicroPulser電穿孔儀4.立體熒光顯微鏡:(LeicaMZ12)為瑞士萊卡儀器公司產(chǎn)品5.熒光顯微鏡:ECLIPSE80i高級研究型顯微鏡6.離心機:EPPENDORF7.凝膠成像儀:BIO-RADUniversalHoodGel-DocUVImagingSystem8.質(zhì)粒DNA:購自AxyGEN生產(chǎn)的AxyPrep質(zhì)粒DNA一.gfp質(zhì)粒的提取1.先在卡那培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)菌液,然后提取該菌液進(jìn)行實驗2.按照AxyGEN生產(chǎn)的AxyPrep質(zhì)粒DNA說明書上的方法進(jìn)行相關(guān)操作3.采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)粒DNA檢測a.凝

3、膠制備:瓊脂糖(1g)+TAE(100ml)微波加熱至透明倒入制膠板中b.2μl質(zhì)粒+2μl單染料滴在制膠板上,同時做mark對照c.140v,30mind.電泳結(jié)束后,用紫外凝膠成像儀和紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果,并記錄→二.X-3感受態(tài)細(xì)胞的制備1.從LB固體平板上挑取新鮮的x-3菌株單菌落于50mlLB液體培養(yǎng)基中,30℃,170r/min振蕩培養(yǎng)過夜,按照1%接種比例接入100mlLB液體培養(yǎng)基中,30℃,170r/min振蕩培養(yǎng),每1h測定1次OD6002.收集生長中期的培養(yǎng)物于冰水浴中放置20min后,用PEB洗滌液沖洗細(xì)胞4次。具體過程:用50mlP

4、EB洗滌液沖洗離心過的菌體,輕輕混勻,然后放于離心機(8000r,5min)離心,重復(fù)四次。這些過程都需要隨時放在冰盒上,保持冷卻。三.電擊轉(zhuǎn)化及熒光觀察1.用250μlPEB洗滌液沖洗最后一次離心的菌體,分別分裝到50μl的離心管中2.取50μl感受態(tài)細(xì)胞+1μl質(zhì)粒(梯度分別為1μl,2.5μl,5μl)置于電轉(zhuǎn)杯上,用槍頭輕輕吹吸,冰上冷卻3.電轉(zhuǎn)儀電擊4.立即用LB培養(yǎng)液活化(1ml),轉(zhuǎn)移到離心管中,震蕩培養(yǎng)1h(120r,37℃)5.取轉(zhuǎn)化后的菌液,分別取10,50,100μl菌液涂布于含有100μg/ml壯觀霉素的LB固體培養(yǎng)基上,30℃培養(yǎng)6.取

5、相關(guān)切片在熒光顯微鏡下觀察是否標(biāo)記上。9、人的價值,在招收誘惑的一瞬間被決定。30-七月-2130-七月-21Friday,July30,202110、低頭要有勇氣,抬頭要有低氣。***7/30/20215:43:04AM11、人總是珍惜為得到。30-七月-21**Jul-2130-Jul-2112、人亂于心,不寬余請。***Friday,July30,202113、生氣是拿別人做錯的事來懲罰自己。30-七月-2130-七月-21**30July202114、抱最大的希望,作最大的努力。30七月2021**30-七月-2115、一個人炫耀什么,說明他內(nèi)心缺少什么

6、。。七月21*30-七月-21*30July202116、業(yè)余生活要有意義,不要越軌。**7/30/202117、一個人即使已登上頂峰,也仍要自強不息。***30-七月-21謝謝大家

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