cdna文庫的構建方法與原理

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1、cDNA文庫的構建方法與原理蛋白質(zhì)是細胞的功能分子：它們構成結構和調(diào)控分子，動力和泵蛋白，酶和受體。然而，如果僅用傳統(tǒng)的生化方法確定某一特異蛋白的全序列，或制備足夠量的蛋白進行操作和鑒定都是使人厭煩且昂貴的步驟?；蚩寺『瓦z傳工程對生化領域有很大貢獻。如果只限于將基因組DNA作為材料來源，由于其中僅2%被認為可能編碼蛋白質(zhì)，那么確定蛋白質(zhì)序列仍然是令人生畏的工作。其他部分包括結構和調(diào)節(jié)因子、內(nèi)含子、非編譯外顯子和重復及功能未知的非編碼序列。如果分析僅局限在編碼序列，那么確定基因產(chǎn)物序列所需的努力就會大大的

2、降低。因此分子生物學主要原則之一是mRNA作為蛋白質(zhì)合成的模板，所以mRNA是確定蛋白質(zhì)序列的理想底物。不幸的是，現(xiàn)有通用的克隆載體沒有一個能容納mRNA分子作為插入片段。因此，產(chǎn)生表達序列文庫的一個基本步驟是將mRNA分子轉變成雙鏈DNA。來自mRNA分子的DNA拷貝稱cDNA，由來自細胞或組織mRNA種類的DNA拷貝組成的文庫稱為cDNA文庫。1．基本原理cDNA（ComplementaryDNA）是以mRNA為模板，在反轉錄酶作用下合成的互補DNA，它的順序可代表mRNA序列。cDNA文庫的構建是指

3、將cDNA與克隆載體DNA體外重組，然后去轉化克隆載體DNA的宿主細胞，從而得到一群含重組DNA的細菌或噬菌體克隆的過程。這些序列來自并代表一定組織或細胞類型特定發(fā)育或分化階段的整個mRNA群體。其過程可概括為：（1）通過反轉錄酶將各種mRNA轉變在cDNA；（2）cDNA與合適的載體重組并導入到宿主中。cDNA基因文庫具有許多優(yōu)點和特殊用途：首先，cDNA克隆以mRNA為起始材料，這對于有些RNA病毒來說非常適用，因為它們的增殖并不經(jīng)過DNA中間體，研究這樣的生物有機體，cDNA克隆是唯一可行的方法。第

4、二，cDNA基因文庫的篩選簡單易行，恰當選擇mRNA的來源，使所構建的cDNA基因文庫中，某一特定序列的克隆達到很高的比例，簡化了篩選特定基因序列克隆的工作量。第三，每一個cDNA克隆都含有一種mRNA序列，在選擇中出現(xiàn)假陽性幾率比較低，從陽性雜交信號選擇出來的陽性克隆一般含有目的基因序列。第四，cDNA克隆的另一用途是用于基因序列的測定，讀碼框（ORF）的界定，只有通過對mRNA5’核苷酸序列才能獲得。2．基本方法2．1mRNA純化構建一個cDNA文庫的第一步是分離在某一給定的組織或細胞類型表達的mRN

5、A。mRNA僅占細胞總RNA的1%～5%，因而需要另外的純化技術來富集mRNA。從細胞總RNA中分離mRNA是根據(jù)實際上所有真核細胞mRNA3’端有一長的伸展的腺嘌呤核苷，這個序列被稱為poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA沒有，poly(A)尾通常有足夠的長度因而能與人工合成的互補的寡脫氧胸苷酸（oligo(dT)）雜交。正是這種特性使得mRNA從RNA分子的混合物中分離出來。方法有三種：·寡脫氧胸苷酸親和層析：即分離mRNA的標準方法，將一個寡脫氧胸苷酸（12~18堿基）連接到纖維素

6、的親和層析柱法，總RNA混合物上樣后，mRNA與寡脫氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不結合并很容易從柱子洗去。用低鹽緩沖液洗柱，己結合的mRNA很快洗脫出來?！と芤弘s交：本方案也用寡脫氧胸苷酸－纖維素，但不用層析柱，而是將基質(zhì)直接加到總RNA溶液中。退火和洗滌步驟通過離心含有RNA沉淀的基質(zhì)在溶液中完成?！ど锼貥擞浌衙撗跣剀账岷玩溍褂H和素包被磁性球珠：本方案中，一個生物素標記的寡脫氧胸苷酸酸引物在溶液中與總RNA退火，然后加入以鏈霉親和素包被的磁性球珠，用磁分離器從大量溶液中分離球珠－mRNA復全體

7、。移去磁分離器，加入洗脫緩沖液，并重復磁性分離步驟。在無鹽的狀態(tài)下，寡脫氧胸苷酸引物從mRNA上解離。2.2cDNA的合成與克隆2.2.1cDNA第一條鏈的合成所有合成cDNA第一條鏈的方法都要用依賴于RNA的DNA聚合酶（反轉錄酶）來催化反應，有兩個關鍵的因素，一個是mRNA模板，另一個反轉錄酶。目前商業(yè)化的反轉錄酶主要有兩種：一種是禽源反轉錄酶(reversetranscriptase)，另一種是鼠源反轉錄酶。兩種酶都無3’－5’外切酶活性，但禽源反轉錄酶有很強的RNAaseH酶活性，鼠源的具有相對較

8、弱的RNAaseH酶活性。RNAaseH酶活性在反應中起負作用，可降解mRNA分子末端的poly(A)序列和cDNA-RNA雜交分子中的RNA。因此一般反轉錄過程都是采用鼠源反轉錄酶。GIBCO-BRL公司出品一種鼠源反轉錄酶，稱為SUPERSCRIPT反轉錄酶，缺少C-末端180個氨基酸，完全去除了其RNAaseH酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。2.2.2cDNA第二條鏈的合成合成cDNA第二條鏈的傳統(tǒng)方法是“自身引導法