互補(bǔ)式親和層析純化制備兔源性抗人精子多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品

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1、互補(bǔ)式親和層析純化制備兔源性抗人精子多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品夏玲芝　沈傳來(lái)　唐秋莎　謝維　張建瓊【摘要】目的：純化制備兔源性抗人精子多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品。方法：利用人精子抗原及其他組織蛋白等分別制備親和層析柱，經(jīng)正反相互補(bǔ)式親和層析從兔抗血清中純化IgG和IgA型抗人精子多克隆抗體，用SDSPAGE、ethodsThreetypeofaffinitychromatographycolumnrespectivelymadefromhumanspermantigen,normalserumandlysateofnorma

2、ltissuecellspolyclonalantibody(IgGandIgA)fromrabbitantihumanspermserum.Theresultingantibodyelinkedimmunoabsorbentassay(ELISA)fordeterminingitspurity,specificityandlinearreactionantigen.ResultsThepurifiedantispermantibodyshoanserum,lysateofhumannormaltiss

3、uecellsmunodiagnosticreagents.Attheconcentrationrangeof0.4882–7.8120ng·ml－１(forIgGisotype)or1.953–31.250ng·ml－１(forIgAisotype),thepurifiedantibodyreactedinELISAantigeninalinearmanner.ConclusionThepurificationscheduleisfeasibleforpreparationofantibodystanda

4、rdusedinantibodyquantitativedetection.　Keyantibody；quantitativeenzymelabeledimmunosorbentassay；affinitychromatography　　我國(guó)不孕育癥發(fā)生率占已婚夫婦的8%～15%，近20%為免疫性不孕育，其中抗精子抗體的重要致病作用已被大量實(shí)驗(yàn)和臨床觀察所證實(shí)〔15〕。存在于男女血清、精漿及宮頸分泌液中的抗精子抗體的濃度高低直接決定著其抗生育效應(yīng)的強(qiáng)弱，也是療效觀察和預(yù)后判斷的有效量化指標(biāo)。因此，抗精子

5、抗體的定量檢測(cè)對(duì)診斷和治療免疫性不孕育非常重要。然而，由于精子抗原種類(lèi)繁多，抗精子抗體標(biāo)準(zhǔn)品不易獲得，目前我國(guó)尚無(wú)廠家生產(chǎn)抗精子抗體定量檢測(cè)試劑盒。大多數(shù)醫(yī)院采用酶標(biāo)法或金標(biāo)法試劑盒進(jìn)行抗精子抗體的定性檢測(cè)，極少數(shù)醫(yī)院采用昂貴的進(jìn)口試劑盒進(jìn)行定量分析〔611〕。但是這些進(jìn)口定量試劑盒實(shí)際上仍屬于半定量的性質(zhì)，他們都只能以U·ml－1來(lái)表示所測(cè)抗精子抗體的濃度，而并不能準(zhǔn)確說(shuō)明一個(gè)U代表多少質(zhì)量（ng或pg）的抗精子抗體，而且每家公司各自定義其標(biāo)準(zhǔn)品中抗精子抗體的單位數(shù)，互不可比。本研究首次利用高純度人精子

6、膜抗原等多種蛋白制劑制備互補(bǔ)式親和層析柱，從經(jīng)人精子免疫的兔血清中提取純化出純度高、與正常人血清蛋白和組織細(xì)胞裂解液無(wú)交叉反應(yīng)的高特異性抗人精子多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品，為進(jìn)一步純化人源性抗人精子多克隆抗體標(biāo)準(zhǔn)品奠定了基礎(chǔ)，有利于我國(guó)抗精子抗體定量檢測(cè)方法的建立。有關(guān)純化方案已申請(qǐng)國(guó)家發(fā)明專(zhuān)利。　1材料與方法　1.1免疫接種及人精子膜抗原的提取純化　取精液常規(guī)檢查為正常的人精液標(biāo)本（從南京金陵男科醫(yī)院收集）200ml，經(jīng)0.01mol·L-1pH7.4PBS離心（1200r·min-1）洗滌3次，用生理鹽水制成精子

7、懸液后常規(guī)免疫家兔3次，皮下多點(diǎn)注射，每次1×106，每次接種間隔2周。末次免疫后2周心臟取血，分離兔血清，分裝后置-70℃冰箱保存?zhèn)溆??！∪司幽た乖捎贸暡ǚ鬯?、NP40萃取與3種互補(bǔ)式親和層析柱(A、B、C柱)相結(jié)合的新提純方案而得，經(jīng)與兩種市售ELISA試劑盒比較，陰陽(yáng)性符合率達(dá)100%，且與正常人血清標(biāo)本無(wú)反應(yīng)，OD值≤0.08〔12〕。　1.2主要試劑　Br活化的SepharoseCL4B、HRP、TMB、DAB（Sigma公司），DEAE52纖維素、SephadexG200（illip

8、ore公司），HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG和羊抗兔IgA（北京天壇生物制品股份有限公司），牛血清白蛋白Ⅴ（BSAⅤ）、小牛血清（FCS）（上海伯奧生物科技有限公司）?！?.3兔血清中總IgG和總IgA的提取純化〔13〕　總IgG提取純化:取免疫兔血清,經(jīng)常規(guī)33%硫酸銨鹽析法粗提IgG型免疫球蛋白,透析除鹽后再分批過(guò)DEAE52纖維素層析柱，用0.01mol·L-1pH7.4PBS洗脫，收集洗脫液，經(jīng)聚乙二醇濃縮至