豬流感病毒h1亞型ha蛋白特異性單克隆抗體的研制

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1、豬流感病毒H1亞型HA蛋白特異性單克隆抗體的研制：李洪濤,劉明,劉春國,杜金玲【摘要】　　目的:研制豬流感病毒抗H1亞型HA特異性單克隆抗體(mAb)。方法:構(gòu)建H1亞型豬流感病毒A/SAb的反應性和特異性。結(jié)果:共獲得3株分泌抗H1亞型豬流感病毒HA蛋白的雜交瘤細胞株,分別命名為8C4、8C6、9D6。mAb腹水ELISA效價在1∶16000～1∶256000之間;HI效價為1∶512～1∶256000;對A/SAb只與H1亞型豬流感病毒HA蛋白反應。結(jié)論:HA蛋白特異性mAb的研制為H1抗原變異分析及H1亞型豬流感診斷方法的建立奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】豬流感;基因免疫;單克隆抗體;

2、血凝抑制　?。跘bstract］AIM:Topreparethemonoclonalantibodies(mAb)againsttheHAproteinofsubtypeH1ofsidsubtypeH1ofSIVHAgeneofA/Siceof6-8munizedendemicallyid.Thesplenocytesfromtheimmunizedmiceyelomacellsafterthelastimmunization.Hybridomacellsagglutinationinhibition(HI)tests.TheactivityandspecificityofmAbsace

3、lllinessecretingspecificmAbsnamed8C4,8C6,and9D6AbsedthatmAbsonlyreactedAbscanbeusedasausefultooltoanalyzetheantigenicvariation.TheyalsoprovidetheeffectivereagentsfortherapiddetectionofsubtypeH1ofSIV.　　［Keymunization;monoclonalantibody;hemagglutinin　　豬流感是規(guī)?；B(yǎng)豬場普遍存在且難以根除的豬群發(fā)性疾病,不僅可直接引起患豬死亡,而且使豬群生產(chǎn)性

4、能下降,對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。更值得重視的是,豬流感病毒（sAb）以其特異性高、敏感性強被廣泛用于各類疾病病原的血清學檢測和診斷中［2］。在動物體內(nèi)由于免疫力的作用,流感病毒表面血凝素基因(hemagglutinin,HA)非常容易發(fā)生抗原漂移［3］,常導致待測病毒與標準檢測抗體的交叉反應性差,給檢測工作帶來許多困難。因此,研制針對SIVHA蛋白mAb,對快速準確地檢測SIV具有重要的應用價值［4］。另外HA蛋白因其具有良好的免疫原性使其成為基因工程疫苗的首選［5］?！　?材料和方法　　1.1材料　　A/Sa公司;mAb亞型鑒定試劑盒購自SouthernBiotech公司;次黃嘌呤氨基蝶呤

5、胸苷培養(yǎng)基（HAT）、次黃嘌呤胸苷培養(yǎng)基(HT)購自Gibco公司;細胞培養(yǎng)用牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司;其他普通生化試劑均為國產(chǎn)分析純?！　?.2方法　　1.2.1引物設(shè)計與合成　　參照GenBank上已發(fā)表的H1亞型SIVHA基因序列設(shè)計引物,序列:P1:5′CGCGCTAGCATGAAGGCAATACTAGTGTTC3′,P2:5′CGCTCGAGTTAGATCGCCAAAATTTGGTAAAT3′由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成,預計目的片段長度1700bp?！　?.2.2H1HA基因PCR擴增　　按常規(guī)PCR方法擴增,程序為:94℃4min,94℃3

6、0s,54℃30s,72℃2min,30個循環(huán)后,72℃10min。擴增產(chǎn)物10g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定?！　?.2.3重組質(zhì)粒的構(gòu)建　　PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳回收純化后與pCIneo質(zhì)粒分別用NheⅠ/XhoⅠ雙酶切,酶切產(chǎn)物電泳回收純化、連接后、轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞,37℃搖床培養(yǎng)1h,涂Amp平板,37℃溫箱過夜培養(yǎng),挑單個菌落接種于LB液體培養(yǎng)基,PCR鑒定。擴大培養(yǎng)陽性菌,用質(zhì)粒抽提試劑盒抽提重組質(zhì)粒,用NheⅠ/XhoⅠ雙酶切鑒定?！　?.2.4抗原制備及免疫　　按文獻［6］所述的方法制備抗原。根據(jù)文獻［7］免疫方法稍作改進,以25μg/只肌肉免疫6周齡小鼠,每隔2周

7、免疫1次,共免疫3次。融合前3d全病毒加強免疫1次。　　1.2.5間接ELISA方法的建立　　采用方陣法確定抗原最佳包被濃度、二抗最佳工作濃度、抗原包被條件、封閉液、封閉時間、被檢血清最佳稀釋度、待檢血清反應時間、酶標二抗反應時間、底物反應時間,間接ELISA方法陰性值和陽性值臨界值的確定?！　?.2.6細胞融合及篩選　　飼養(yǎng)層細胞、免疫脾細胞的制備以及細胞融合按參考文獻［8］進行。當雜交瘤細胞生長至1/3～1/2孔底面積時,吸取上