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1、菲立磁標記的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤觀察陳小伍，方馳華，劉勝軍，崔冰，王巖，黃治榮【關(guān)鍵詞】骨髓基質(zhì)干細胞；菲立磁；磁共振成像；干細胞移植【Abstract】AIM：Tostudythemethodoftrackingofallogenicallygraftedratbonemarrocells（BMSCs）labeledinedbyPrussianbluestainingandelectronmicroscopy.SuccessfullylabeledBMSCs(2.0mL，1×109/L)aandcaudalveinoftheSDr
2、ats.Sixhoursbeforetransplantationand6h,1,3,and5agicresonanceimaging(MRI)examination(thesequencesusededthelabelingefficiencyissionelectronmicroscopyshoerousironparticlesinthecytoplasmofFeridexlabeledBMSCs.MRI(SET2SCscanbetrackedeffectivelyinratliverbyMRI.【Keyarrocells；Feridex；magicr
3、esonanceimaging；stemcelltransplantation【摘要】目的：研究菲立磁標記的大鼠骨髓基質(zhì)干細胞(BMSCs)在同種異體移植鼠肝臟中的追蹤方法.方法：采用菲立磁（Feridex）對分離培養(yǎng)的BMSCs進行標記，Prussianblue染色和電鏡觀察對標記后的BMSCs進行鑒定；取鑒定后的BMSCs2mL（1×109/L）分別注射到SD異體大鼠的門靜脈、肝局部實質(zhì)、尾靜脈內(nèi)；采用磁共振成像(MRI)技術(shù)（SET2SCs）在一定的條件下，可分化為有功能的肝細胞，且獲取及體外培養(yǎng)容易，沒有倫理道德的爭議，可以作為種子細胞來治療急慢性肝
4、功能衰竭和修復肝臟損傷，具有極大的研究價值.但同種異體移植后BMSCs在活體肝內(nèi)的定居、遷移和分化機制尚不清楚.我們利用直徑為納米級別的超順磁性氧化鐵粒子菲立磁（feridex）對大鼠BMSCs進行標記，并利用磁共振成像(magicresonanceimaging，MRI)技術(shù)對多種途徑同種異體移植的BMSCs在大鼠肝內(nèi)進行了定位與追蹤.1材料和方法1.1材料SD清潔級大鼠（80～100g，2只，供提取骨髓用；200～220g，雄性36只，供同種異體細胞移植用）購自廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院動物實驗室.Feridex購自美國泛華醫(yī)藥公司.DMEM（低糖）培養(yǎng)基購自美
5、國GIBCO公司；優(yōu)質(zhì)胎牛血清購自奧地利PAA公司；胰蛋白酶購自AMERSCO公司；其他化學試劑為國產(chǎn)分析純.Olympus相差顯微鏡，HERAEUS超凈臺，F(xiàn)ORUMCO2培養(yǎng)箱，東芝1.5T超導MRI機（型號Exelart/P3）.1.2方法1.2.1BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定及傳代percoll梯度離心法(連續(xù)密度梯度離心分離法)分離純化大鼠BMSCs.采用密度為1.073kg/L的Percoll液分離骨髓液，離心后BMSCs將聚積在第二層.完整取大鼠雙后肢股骨，DHanks液吹吸骨髓.抗凝骨髓經(jīng)低糖的DMEM培養(yǎng)基稀釋.將比重為1.073kg/L的P
6、ercoll置試管底部，按照1∶1的比例緩慢滴加稀釋后的骨髓，900g/min離心30min.收獲分離的單個核細胞，DMEM洗兩次，接種于24孔板內(nèi)，各孔內(nèi)加入100mL/L胎牛血清，48h后除去非貼壁細胞，更換新鮮培養(yǎng)液，50mL/LCO2，37℃和飽和濕度的條件下培養(yǎng)，待細胞生長至瓶底90%融合時，2.5g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng).收集第4代BMSCs，流式細胞儀檢測CD29，CD44，CD45等表面標志、成骨誘導后行細胞堿性磷酸酶染色.具體方法參照文獻〔3〕.1.2.2Feridex標記BMSCs的制備取第3代對數(shù)生長期的BMSCs，消化后機械吹打成
7、單細胞，以約5×108/L的密度接種到含有不同濃度Feridex的200mL/L胎牛血清培養(yǎng)基(低糖DMEM)中孵育.標記培養(yǎng)基中Fe3+濃度為16.8mg/L.50mL/LCO2，37℃培養(yǎng)48h.2.5g/L胰蛋白酶消化，PBS重懸，計數(shù)后備用.Prussianblue染色及透射電鏡鑒定鐵顆粒是否被吞噬進細胞.1.2.3Feridex標記BMSCs大鼠同種異體移植及MRI追蹤細胞移植：36只SD大鼠同室同條件飼養(yǎng).設門靜脈組、肝內(nèi)注射組、尾靜脈組，每組6只，并每組設6只為對照.經(jīng)10mg/L水合氯醛（1mg/kg體質(zhì)量）腹腔麻醉后固定，①門靜脈組、肝內(nèi)組
8、：消毒腹部皮膚，分層進入腹腔，暴露肝臟，顯露肝門部，
