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《高效液相色譜（hplchighperformanceliquid》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、高效液相檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)講義高效液相色譜（HPLC：HighPerformanceLiquidChromatography）是化學(xué)、生物化學(xué)與分子生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、商檢、藥檢、法檢等學(xué)科領(lǐng)域與專業(yè)最為重要的分離分析技術(shù)，是分析化學(xué)家、生物化學(xué)家等用以解決他們面臨的各種實(shí)際分離分析課題必不可缺少的工具。國(guó)際市場(chǎng)調(diào)查表明，高效液相色譜儀在分析儀器銷售市場(chǎng)中占有最大的份額，增長(zhǎng)速度最快。高效液相色譜的優(yōu)點(diǎn)是：檢測(cè)的分辨率和靈敏度高，分析速度快，重復(fù)性好，定量精度高，應(yīng)用范圍廣。適用于分析高沸點(diǎn)、大
2、分子、強(qiáng)極性、熱穩(wěn)定性差的化合物。其缺點(diǎn)是：價(jià)格昂貴，要用各種填料柱，容量小，分析生物大分子和無機(jī)離子困難，流動(dòng)相消耗大且有毒性的居多。目前的發(fā)展趨勢(shì)是向生物化學(xué)和藥物分析及制備型傾斜。一、基本原理加樣流動(dòng)相固定相流動(dòng)相AABCBCBA固定相——柱內(nèi)填料，流動(dòng)相——洗脫劑。HPLC是利用樣品中的溶質(zhì)在固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)的不同，進(jìn)行連續(xù)的無數(shù)次的交換和分配而達(dá)到分離的過程。通常，按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)可以作如下的分類：分配色譜：——分配系數(shù)親和色譜：——親和力吸附色譜：—
3、—吸附力離子交換色譜：——離子交換能力凝膠色譜（體積排阻色譜）：——分子大小而引起的體積排阻分配色譜又可分為：正相色譜：固定相為極性，流動(dòng)相為非極性。高效液相檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)講義反相色譜：固定相為非極性，流動(dòng)相為極性。用的最多，約占60～70％。固定相（柱填料）：固定相又分為兩類，一類是使用最多的微粒硅膠，另一類是使用較少的高分子微球。后者的優(yōu)點(diǎn)是強(qiáng)度大、化學(xué)惰性，使用pH范圍大，pH=1～14，缺點(diǎn)是柱效較小，常用于離子交換色譜和凝膠色譜。最常使用的全孔微粒硅膠（3～10μm）是化學(xué)鍵合相硅膠，這種
4、固定相要占所有柱填料的80％。它是通過化學(xué)反應(yīng)把某種適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)官能團(tuán)（例如各種有機(jī)硅烷），鍵合到硅膠表面上，取代了羥基（－OH）而成。它是近代高效液相色譜技術(shù)中最重要的柱填料類型。使用微粒硅膠要特別注意它的使用pH范圍是2～7.5，若過堿（＞pH7.5），硅膠會(huì)粉碎或溶解；若過酸（＜pH2），鍵合相的化學(xué)鍵會(huì)斷裂。鍵合相使用硅膠作基質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)是：①硅膠的強(qiáng)度大；②微粒硅膠的了孔結(jié)構(gòu)和表面積易人為控制。③化學(xué)穩(wěn)定性好。最常用的“萬能柱”填料為“C18”，簡(jiǎn)稱“ODS”柱，即十八烷基硅烷鍵合硅膠填料（O
5、ctadecylsilyl，簡(jiǎn)稱ODS）。這種填料在反相色譜中發(fā)揮著極為重要的作用，它可完成高效液相色譜70～80％的分析任務(wù)。由于C18(ODS)是長(zhǎng)鏈烷基鍵合相，有較高的碳含量和更好的疏水性，對(duì)各種類型的生物大分子有更強(qiáng)的適應(yīng)能力，因此在生物化學(xué)分析工作中應(yīng)用的最為廣泛，近年來，為適應(yīng)氨基酸、小肽等生物分子的分析任務(wù)，又發(fā)展了CH、C3、C4等短鏈烷基鍵合相和大孔硅膠（20～40μm）。按鍵合到基質(zhì)上的官能團(tuán)可分為：⑴反相柱：填料是非極性的，官能團(tuán)為烷烴，例如：C18(ODS)、C8、C4等。
6、⑵正相柱：填料是極性的，官能團(tuán)為－CN氰基、－NH2氨基等。⑶離子交換鍵合相：陽離子官能團(tuán)：－SO3H磺酸基、－COOH羧基等。陰離子官能團(tuán)：―R4N＋季銨基、-氨基等。(由于硅膠基質(zhì)的鍵合相只能在pH＝2～7.5的范圍內(nèi)使用，而離子交換色譜要求有更寬的pH范圍，因此其基質(zhì)現(xiàn)在仍主要使用聚苯乙烯和二乙烯苯。)流動(dòng)相：高效液相檢測(cè)技術(shù)培訓(xùn)講義反相色譜最常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度如下：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜異丙醇＜四氫呋喃最常用的流動(dòng)相組成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的劇毒
7、性，通常優(yōu)先考慮“甲醇—H2O”流動(dòng)相。反相色譜中，溶質(zhì)按其疏水性大小進(jìn)行分離，極性越大疏水性越小的溶質(zhì)，越不易與非極性的固定相結(jié)合，所以先被洗脫下來。流動(dòng)相的pH對(duì)樣品溶質(zhì)的電離狀態(tài)影響很大，進(jìn)而影響其疏水性，所以在分離肽類和蛋白質(zhì)等生物大分子的過程中，經(jīng)常要加入修飾性的離子對(duì)物質(zhì)，最常用的離子對(duì)試劑是三氟乙酸（TFA），使用濃度為0.1％，使流動(dòng)相的pH值為2～3，這樣可以有效地抑制氨基酸上α羧基的離解，使其疏水性增加，延長(zhǎng)洗脫時(shí)間，提高分辨率和分離效果。完全離子化的溶質(zhì)，例如強(qiáng)酸或強(qiáng)堿，其在
8、反相鍵合相上的保留值很低，近于死時(shí)間流出，不能進(jìn)行分析。根據(jù)離子對(duì)色譜的原理將一種與樣品離子電荷（A＋）相反的離子（B－），稱為對(duì)離子，加入到流動(dòng)相中，使其與樣品離子結(jié)合生成弱極性的離子對(duì)，即中性締合物，從而增強(qiáng)了樣品的疏水性，加大了保留值，改善了分離效果。正相色譜常用的流動(dòng)相及其沖洗強(qiáng)度的順序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜異丙醇其中最常用的是正已烷，雖然其價(jià)格較貴，但80％的順、反和鄰位、對(duì)位異構(gòu)體仍然要用正相色譜來進(jìn)行分離。流動(dòng)相的選擇原則是：①樣品易溶，且溶解度盡可能大。②化學(xué)
