豬維甲酸誘導基因irigi的克隆及其在誘導型干擾素中作用研究

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1、豬維甲酸誘導基因IRIGI的克隆及其在誘導型干擾素中作用研究（可編輯）機體的天然免疫系統(tǒng)在抵抗病毒感染方面發(fā)揮著重要作用。病毒感染宿主細胞后，宿主細胞可以通過模式識別受體patternrecognitionreceptor，PRR偵測病原pathogen(associated相關分子模式主的天然免疫反應，誘導干擾素IFN、促炎癥細胞因子等一系列抗病毒因子的產但由于TLR家族成員均為跨膜蛋白，只能識別細胞外或內體中的RNA病毒，對于細胞質中的RNA病毒，TLR則無法做出反應。RIG(I樣受體RIG(I(1ikereceptor，RLR是一類新發(fā)現(xiàn)的PRR，能夠識別細胞質中的病毒RNA

2、，誘導干擾素和促炎癥細胞因子的產生，對抗病毒天然免疫的建立起著至關重要的作用。對人RIG(I基因的結構、誘導干擾素產生的機制等已研究較為清楚，但有關豬RIG(I的研究尚無報道，鑒于此，本研究對豬RIG(I進行了克隆，并對其在誘導I型干擾素中的作用做了初步研究。主要研究內容如下:1(豬mG-I基因克隆與序列分析取豬的外周血單核細胞總RNA作模板RT-PCR一步法擴增豬RIG(I基因，碼框全長為2832bps，編碼943個氨基酸殘基。與牛、馬、人、黑猩猩、猴的氨基酸同源性分別為82(3,、80(2,、80(2,、79(7,、和78(8,，與小鼠、大鼠和鴨嘴(I氨基酸序列與牛的親緣獸的同

3、源性較低，進化系統(tǒng)樹分析也表明豬RIG關系最近。2(豬RIG4基因全長及突變體重組質粒的構建N端以及RIG(I以pMDl8-RIG(I為模板，PCR分別擴增RIG(I全長編碼區(qū)、RIG(IC端編碼區(qū)片段，將純化后的PCR產物經BamHI和Hind?I雙酶切后分別與經同―RIG―I-N和Tag―RIG―I―C。Tag3(豬RIG(I在誘導干擾素產生中的作用根據(jù)信號轉導受體復合物的不同以及序列同源性，IFN可分為I型與II型，型IFN只包含1個家族成員，即IFN吖，而I型IFN則是多基因家族的產物，包括又發(fā)現(xiàn)了新的IFN(九家族。人I型IFN基因位于9號染色體短臂，均缺乏內含子。IFN

4、(a基因編碼的前IFN蛋白，包括1種信號前導肽和1種成熟肽。信號肽能夠引導IFN(a通過細胞膜而分泌到細胞外，然后信號肽通過蛋白分解，保留成熟的IFN蛋白。IFN-丫含有3個內含子，其基因位于人12號染色體長臂。在未經誘導的細胞中，IFN基因通常并不表達。在病毒、雙鏈RNA、多肽、細菌脂多糖以及細胞因子的作用下，I型IFN可被誘導產生;II型IFN是在多種免疫刺激下，如T細胞特異性抗原、葡萄球菌內毒素A、植物血凝素、佛波醇等的刺激，由活化的T細胞、NKGCetCAet細胞與NKT細胞產生Sena1(，2001;Birona1(，1999但其他細胞類型，如巨噬細胞、樹突細胞DC和丫6

5、T細胞在特定的條件下也能夠表達IFN吖。只要進行合適的刺激，幾乎所有細胞類型均能產生I型IFN，早期研究發(fā)現(xiàn)，人外周血單核細胞PBMC中有很少部分的淋巴細胞在體外感染不同的病毒時能FPeta1(，1999，但也有研究表明，在不同的病毒感染中IFN(o(,IFN(D的主要產生細SSet胞可能并不是同樣的細胞部分Diebolda1(，2003，在體內感染中，有更多的細胞類型可能對于IFN-o(,IFN(D的產生是重要的。組織學研究表明，成纖維細胞主多于IFN(D。因而認為，IFN-G與IFN(p的不同表達不但依賴于細胞類型，而且依賴BJetEMet于病毒刺激以及細胞內的轉錄因子Barn

6、esa1(，2001:Cocciaa1(，2004。1(1(2IFN的轉錄調節(jié)與誘導表達IFN基因表達的調節(jié)位點分為正性調節(jié)區(qū)為病毒誘導所需以及負性調節(jié)區(qū)與基因誘導前的穩(wěn)定抑制有關。以IFN(a基因為例，IFN(Q基因的5，側翼區(qū)表現(xiàn),的同源性，病毒通過IFN(a的5館動子區(qū)誘導其轉錄。通過多序列為75排列以及豬維甲酸誘導基因IRIG(I的克隆及其在誘導l型干擾素中的作用研究etJL核酸序列的同源性分析了11種不同的IFN(a啟動子核苷酸序列Houlea1((1996，發(fā)現(xiàn)了IFN(Q啟動子區(qū)含有高度保守的病毒應答元件，并發(fā)現(xiàn)6個家族的潛在的IFN(a轉錄元件:TATA盒、GTAT

7、GT位點、病毒反應元件、末端與近端兩個IFN調節(jié)因子樣結合位點、TG序列。這些保守區(qū)對于IFN(a的轉錄調節(jié)可能YTetIeta1(，1998;Marie表明，IRF3能夠結合并活化IFN(al與IFN(毗啟動子JuangReta1(，1998;Lina1(，2000。在正常情況下，IRF位于胞漿，并處于失活狀態(tài)或者只而在病毒誘導或者IFN作用下，IRF通過磷酸化或者二聚體是低水平表達，化而活WCet化，并轉移至細胞核Aua1(，1995。對于IFN(D，3個家族的轉