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1、TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)原理和方法 細(xì)胞凋亡中染色體DNA的斷裂是個(gè)漸進(jìn)的分階段的過程，染色體DNA首先在內(nèi)源性的核酸水解酶的作用下降解為50-300kb的大片段。然后大約30﹪的染色體DNA在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內(nèi)切酶作用下，在核小體單位之間被隨機(jī)切斷，形成180～200bp核小體DNA多聚體。DNA雙鏈斷裂或只要一條鏈上出現(xiàn)缺口而產(chǎn)生的一系列DNA的3’-OH末端可在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）的作用下，將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶或生物素形成的衍生物標(biāo)記到DNA的
2、3’-末端，從而可進(jìn)行凋亡細(xì)胞的檢測(cè)，這類方法一般稱為脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3’-OH形成，很少能夠被染色。低分子量的DNA分離后，也可使用DNA聚合酶進(jìn)行缺口翻譯（nicktranslation），使低分子量的DNA標(biāo)記或染色，然后分析凋亡細(xì)胞。TUNEL或缺口翻譯法實(shí)際上是分子生物學(xué)與形態(tài)學(xué)相結(jié)合的研究方法，對(duì)完整的單個(gè)凋亡細(xì)胞核或凋亡小體進(jìn)行原位染色，能準(zhǔn)確的反應(yīng)細(xì)胞凋亡最典型的生物化學(xué)和形態(tài)特征，可用于石蠟包埋
3、組織切片、冰凍組織切片、培養(yǎng)的細(xì)胞和從組織中分離的細(xì)胞的細(xì)胞凋亡測(cè)定，并可檢測(cè)出極少量的凋亡細(xì)胞，靈敏度遠(yuǎn)比一般的組織化學(xué)和生物化學(xué)測(cè)定法要高，因而在細(xì)胞凋亡的研究中已被廣泛采用?！ ∫弧⑦^氧化物酶標(biāo)記測(cè)定法 原理：脫氧核糖核苷酸衍生物地高辛[（digoxigenin）-11-dUTP]在TdT酶的作用下，可以摻入到凋亡細(xì)胞雙鏈或單鏈DNA的3-OH末端，與dATP形成異多聚體，并可與連接了報(bào)告酶（過氧化物酶或堿性磷酸酶）的抗地高辛抗體結(jié)合。在適合底物存在下，過氧化物酶可產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)，特異準(zhǔn)確的定位出正
4、在凋亡的細(xì)胞，因而可在普通光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察?！ ∶攸S植物是地高辛的唯一來源。在所有動(dòng)物組織中幾乎不存在能與抗地高辛杭體結(jié)合的配體，因而非特異性反應(yīng)很低。抗地高辛的特異性抗體與脊椎動(dòng)物甾體激素的交叉反應(yīng)不到1％，若此抗體的Fc部分通過蛋白酶水解的方法除去后，則可完全排除細(xì)胞Fc受體非特異性的吸附作用?！ ”痉椒梢杂糜诟栺R林固定的石蠟包埋的組織切片、冰凍切片和培養(yǎng)的或從組織中分離的細(xì)胞凋亡測(cè)定。檢測(cè)晚期凋亡?；驹恚簩?duì)不同組織切片先增加細(xì)胞膜通透性，然后讓rTDT和bio標(biāo)記的dTUTP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在r
5、TDT的輔助下dTUTP與核斷裂的DNA3’-OH結(jié)合，再用HRP標(biāo)記的鏈霉親和素與dTUTP上biotin結(jié)合（每個(gè)鏈霉親和素至少可以再結(jié)合3個(gè)biotin分子），最后用DAB、過氧化氫與SP上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng)，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色，最終通過計(jì)數(shù)每張切片上不同視野中TUNEL陽性細(xì)胞的比例來判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。羅氏試劑盒一、試劑1、酶濃縮溶液5×50μl——末端脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶（10×）試劑2、標(biāo)記溶液5×550μl——含有核苷酸混合液的反應(yīng)液（1×）試劑3、轉(zhuǎn)化劑-POD
6、3.5ml——酶標(biāo)記抗熒光素抗體（即用型，融后4℃保存）二、所需的溶液和儀器10mMTris/HCl（pH7.4~7.8）、PK配制、DAB、飯盒、吹風(fēng)機(jī)、3%H2O2甲醇溶液、PBS、蓋玻片、中性樹膠、蘇木素、二甲苯和無水乙醇（用量多）、雙蒸水（用以配梯度酒精）1,充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60度20min，石蠟切片于染色缸中，二甲苯浸洗2次共5min,100%、95%、90%、80%、70%乙醇浸洗3min×5；②3%過氧化氫甲醇中浸洗10-15min，抑制內(nèi)源性過氧化氫酶。③用蛋白酶K（20μg/ml溶于
7、Tris/HCl中，pH7.4~8.0）室溫孵育15~30分鐘。④PBS洗約5min*2次，擦干樣品周圍的水。此階段配制TUNEL反應(yīng)混合物——從試劑2中取出100μl標(biāo)記溶液作為兩個(gè)陰性對(duì)照；將試劑1中取5μl+試劑2中45μl標(biāo)記液中，配成50μlTUNEL反應(yīng)混合物混勻（即配即用，4℃避光?。輼?biāo)記反應(yīng)：滴加50μl的TUNEL反應(yīng)混合液，在濕盒中37℃孵育60分鐘（為防蒸發(fā)和保證TUNEL反應(yīng)混合物均勻分布，可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS洗5min*3次，至此樣品可在熒光鏡下（綠色）分析結(jié)果。⑥信
8、號(hào)轉(zhuǎn)化和分析：擦干樣品周圍的水分，加入50ul轉(zhuǎn)化劑-POD，濕盒中37℃孵育20~30分鐘（可以在孵育過程中加蓋蓋玻片）。PBS洗5min*3~5次??⑦加入50~100μlDAB底物溶液，室溫（10~25℃）孵育5~10min，PBS洗5min*3次。（蘇木素染1-3秒，以免視野全染，需要摸索條件）⑧中性樹膠或者甘油封片（在封片前可以復(fù)染），光鏡下分析結(jié)果。?穩(wěn)定性：TUNEL反應(yīng)
