TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡.doc

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1、細(xì)胞在發(fā)生凋亡時(shí)，會(huì)激活一些DNA內(nèi)切酶，這些內(nèi)切酶會(huì)切斷核小體間的基因組DNA?；蚪MDNA斷裂時(shí)，暴露的3’-OH可以在末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶(TerminalDeoxynucleotidylTransferase,TdT)的催化下加上熒光素(FITC)標(biāo)記的dUTP(fluorescein-dUTP)，從而可以通過熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，這就是TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡的原理。TUNEL法特異性檢測細(xì)胞凋亡時(shí)產(chǎn)生的DNA斷裂，但不會(huì)檢測出射線等誘導(dǎo)的DNA斷裂(和細(xì)胞凋亡時(shí)的斷裂方式不同)。這樣一方面可以把凋亡和壞死區(qū)分開，另一方面也不會(huì)把射線等誘導(dǎo)發(fā)生DNA斷裂的非凋亡細(xì)胞判斷為凋

2、亡細(xì)胞。針對(duì)問題2（TUNEL法的實(shí)驗(yàn)原理是什么？）：基本原理：對(duì)不同組織切片先增加細(xì)胞膜通透性，然后讓rTDT和bio標(biāo)記的dUTP進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，在rTDT的輔助下dUTP與核斷裂的DNA3’-OH結(jié)合，再用HRP標(biāo)記的鏈霉親和素與dUTP上的biotin結(jié)合（每個(gè)鏈霉親和素至少可以再結(jié)合3個(gè)biotin分子），最后用DAB、過氧化氫與SP上的辣根過氧化物酶HRP發(fā)生氧化、環(huán)化反應(yīng)，形成苯乙肼聚合物而呈現(xiàn)棕褐色，最終通過計(jì)數(shù)每張切片上不同視野中TUNEL陽性細(xì)胞的比例來判斷細(xì)胞凋亡發(fā)生情況。1.TUNEL工作原理：簡單說就是——TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒是用來檢測細(xì)胞在凋亡過程中細(xì)胞核DNA

3、的斷裂情況。其原理是；生物素（biotin）標(biāo)記的dUTP在脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdTEnzyme）的作用下,可以連接到凋亡細(xì)胞中斷裂的DNA的3'－OH末端，并可與連接了的辣根過氧化酶的鏈霉親和素（Streptavidin-HRP）特異結(jié)合，在辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺（DAB）的存在下，產(chǎn)生很強(qiáng)的顏色反應(yīng)（呈深棕色），特異準(zhǔn)確地定位正在凋亡的細(xì)胞，因而在普通顯微鏡下即可觀察和計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞；由于正常的或正在增殖的細(xì)胞幾乎沒有DNA的斷裂，因而沒有3'-OH形成，很少能夠被染色。針對(duì)問題3（TUNEL實(shí)驗(yàn)中幾個(gè)關(guān)鍵步驟是什么？）：1.充分脫蠟和水化。脫蠟可以先60度20min，再用二甲

4、苯兩次5~10min；而水化用梯度乙醇從高濃度到低濃度浸洗，這些以便后面的結(jié)合反應(yīng)充分、均勻；2.把握好細(xì)胞通透的時(shí)間。一般根據(jù)切片的厚薄，選擇蛋白酶k的孵育時(shí)間，常用10~30min，幾u(yù)m切片用短時(shí)間；幾十um切片用長時(shí)間，通過摸索達(dá)到既不脫片，有能夠使后面的酶和抗體進(jìn)入胞內(nèi)。3.適當(dāng)延長TUNEL反應(yīng)液的時(shí)間。一般是37度1h，你也可以根據(jù)你的凋亡損傷程度，選擇更長的時(shí)間，可長至2h，但要結(jié)合你最終的背景著色。4.DAB顯色條件的選擇。一般DAB反應(yīng)10分鐘左右，結(jié)合鏡下控制背景顏色，最長不超過30min；我不喜歡用promega公司提供的DAB液（桃紅色），不利于辨認(rèn)棕褐色。5.PBS

5、的充分清洗。我個(gè)人認(rèn)為，在TUNEL反應(yīng)后和酶標(biāo)反應(yīng)后的清洗應(yīng)十分嚴(yán)格，可增加次數(shù)達(dá)5次，因?yàn)檫@些清洗直接決定最后切片的非特異性著色。6.此外，內(nèi)源性POD的封閉也十分關(guān)鍵。對(duì)于肝臟、腎臟等血細(xì)胞含量多的組織，我的經(jīng)驗(yàn)是適當(dāng)延長封閉時(shí)間和升高過氧化氫的濃度，可以達(dá)到很好的封閉效果，且不影響最終的特異性染色。針對(duì)問題5.細(xì)胞通透的原理、通透劑的濃度、孵育時(shí)間及其配制方法？1.蛋白酶K是消化膜蛋白，從而起打孔作用，增加膜通透性，使rTDT酶、抗體易透過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞反應(yīng)；2.蛋白酶K一般工作液濃度為20ug/ml,但濃縮液可配制1~10mg/ml，可用PBS配制，也可用蛋白酶K緩沖液（100mMT

6、risHClPH8.0+50mMEDTA）；3.蛋白酶K反應(yīng)時(shí)間一般為10~30min，具體時(shí)間長短與切片厚薄有關(guān)，4um左右的片子可以用10min，但30um左右的可用30min，最終通過摸索最佳時(shí)間。過長易脫片、過短起不到通透效果。1.抗原修復(fù)的原因是標(biāo)本在甲醛等固定過程中，因發(fā)生蛋白交聯(lián)和甲醛的封閉作用使抗原性降低，可以通過抗原修復(fù)使抗原決定族充分暴露出來；2.免疫組化中經(jīng)常使用抗原修復(fù)，因?yàn)樗脑碇饕强乖涂贵w反應(yīng)，通過抗原修復(fù)使更多的抗原與抗體結(jié)合，避免假陰性結(jié)果；3.而TUNEL的原理是dUTP與斷裂的DNA上的3‘OH結(jié)合，故不需抗原修復(fù)；4.第一次TUNEL反應(yīng)只需37度反

7、應(yīng)1h，或者延長時(shí)間即可1.PROMEGA公司去年是40t要3300元（按100ul/片，實(shí)際可根據(jù)切片大小，加到30ul/pian）；而roche公司一般10t國內(nèi)分裝1300元（同樣也是100/pian）；2.兩個(gè)公司試劑盒內(nèi)均沒有PBS試劑，也不含DNase（以制作標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照片）；3.我一般用4%PFA多聚甲醛，至少浸泡24h后進(jìn)行石蠟包埋、制片。此外，Promega公司在操作步驟中加了兩步4