離子色譜-脈沖安培法測定鏈霉素及雜質(zhì)

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1、離子色譜-脈沖安培法測定鏈霉素及雜質(zhì)摘要：本文采用離子色譜-脈沖安培法測定鏈霉素以及其雜質(zhì)的含量。采用CarbonpacPA1陰離子分析柱分離，以電化學(xué)為檢測器。用去離子水提取YPD發(fā)酵液的鏈霉素，以16000r/min的速度離心后，上清液稀釋100倍直接進(jìn)樣分析。實驗結(jié)果表明，在一定的色譜條件下，鏈霉素及其雜質(zhì)離子具體很好的線性，和重現(xiàn)性，及較低的檢出限。關(guān)鍵詞：離子色譜；脈沖安培；鏈霉素新霉素是水溶性的氨基糖苷類抗生素復(fù)合體，一般是從放射菌類鏈霉素的發(fā)酵產(chǎn)物中純化出來的，主要用于靜脈注射以治療感染。

2、在臨床使用前，鏈霉素在使用之前必須測定主成分以及標(biāo)注所有的雜質(zhì)成分。氨基糖苷類抗生素及其雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)和糖類似，都沒有明顯的發(fā)色基團(tuán)，用紫外－可見光檢測器的靈敏度達(dá)不到要求。另外在制備和貯藏過程中引入的一些中間體或雜質(zhì)具有較好的紫外或可見光吸收基團(tuán)，使用紫外－可見光檢測器直接進(jìn)樣分析會有很大的干擾鏈霉素A及其雜質(zhì)的定量。示差折光率檢測器與紫外－可見光檢測器的局限性類似。在本文中采用高效陰離子交換色譜（HPAE）分離鏈霉素A及其雜質(zhì)[13，17]，選用的CarboPacPA1陰離子交換柱對鏈霉素A及其雜質(zhì)進(jìn)行

3、分離，采用EG50淋洗液發(fā)生器，采用一次性金（Au）工作電極作為電化學(xué)檢測器的工作電極。此方法精確度好、檢出限低、線性和方法的重現(xiàn)性好[17，25，26]。圖1.檢測鏈霉素和二氫鏈霉素的色譜圖2.70和63mMNaOH分析鏈霉素的對比1．實驗部分1.1儀器及試劑DionexICS3000系統(tǒng)，包括D梯度雙泵或者SP梯度單泵（帶有真空脫氣裝置和GM-4梯度混合裝置），DC檢測器模塊(帶雙溫控區(qū))，20uL進(jìn)樣環(huán)，ECD電化學(xué)池配復(fù)合pH/Ag/AgCl參比電極，一次性金工作電極；AS自動進(jìn)樣器（帶分流閥）

4、以及2ml進(jìn)樣瓶；Chremoleon工作站。氦氣（99.995％）；過濾裝置，0.2um尼龍膜過濾裝置；真空泵；聚丙烯自動進(jìn)樣器小瓶；離心管（1.5ml）。鏈霉素A（鏈霉素硫酸鹽，美國藥典準(zhǔn)參考物質(zhì)）試劑均購于Sigma-Aldrich。BactoYPDBroth(PfizerConsumerHealthcare,BDLaboratories,Cat#0428-17-5)。標(biāo)準(zhǔn)溶液均由1000mg/L的貯備液（置于-40℃冰箱中）稀釋配制，溶液均用18.2MΩ.cm的二次去離子水配制。1.2色譜條件色

5、譜柱：CarboPacPA1分析柱，4x250mm，CarboPacPA1保護(hù)柱；流速：0.5mL/min；進(jìn)樣體積：20uL；溫度：柱溫30°C，檢測器溫度25°C；檢測器（ED50）：脈沖安培檢測器，AAA-Direct，一次性金電極，參比電極為pH模式；淋洗液通道A：水，淋洗液通道B：250mMNaOH。等度程序：分離的淋洗液濃度70mMNaOH；梯度程序：0-22min70mMNaOH,22-40min200mMNaOH;40-60min70mMNaOH。1.3系統(tǒng)適應(yīng)性樣品制備熱降解鏈霉素A會

6、產(chǎn)生一系列的產(chǎn)物，但是單一主組分可用于確認(rèn)色譜系統(tǒng)的分離度是否符合系統(tǒng)適應(yīng)性實驗。主降解峰和鏈霉素A的分離度要大于3。準(zhǔn)備系統(tǒng)適應(yīng)性實驗，可在密封的玻璃瓶中放置1ml30μg/mL鏈霉素B，加熱1小時。不要使用塑料的管子。表1鏈霉素A檢測電位1.4鏈霉素和雙氫二鏈霉素降解研究評價鏈霉素和雙氫二鏈霉素的雜質(zhì)隨時間的變化是通過將樣品的溫度提高。在水中溶解41μΜ鏈霉素和雙氫二鏈霉至少，加熱至75℃，加熱時間分別為0，60min以及24h。評價處理樣品中雜質(zhì)含量的變化。圖3.采用70mMNaOH分析USP和商

7、品化鏈霉素硫酸鹽的對比圖1.5YPDBrothMedia樣品前處理溶解1.0gYPD發(fā)酵液到20mL過濾的去離子水中。以16000r/min的速度離心10min,然后稀釋1000倍。回收率測定，加鏈霉素濃縮液到上清液中，然后稀釋至樣品中加入標(biāo)樣的濃度為10。上清液直接進(jìn)樣分析。2．結(jié)果與討論2.1分離圖2是采用CarbonPacPA1柱，70mMNaOH為流動相分析10μΜUSP純鏈霉素A（峰8）以及柱死體積的色譜圖。鏈霉素A與其雜質(zhì)的分離取決于淋洗液的濃度。表上為淋洗液濃度與鏈霉素A保留時間的影響關(guān)系

8、圖。在淋洗液50-77之間，淋洗液濃度的變化對出峰時間的影響最大。圖3比較了以63mMNaOH和70mMNaOH為淋洗液分析譜圖對比。雖然采用63mMNaOH，雜質(zhì)峰的分離度變大，但是分析速度變慢而且峰拖尾長。70mMNaOH為流動相的分離度可以達(dá)到分析的需求。雜質(zhì)峰的出峰時間為8min(圖3，色譜A,峰12)，主要的雜質(zhì)峰為鏈霉菌二糖胺。圖4為采用70mMNaOH分析10μΜUSP鏈霉素硫酸鹽和其它商業(yè)化產(chǎn)品中雜質(zhì)的含量的對圖。色譜A中的