血清白蛋白的分離純化及鑒定（一）鹽析g25脫鹽g75層析課件

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1、血清白蛋白分離與純化實驗目的1.了解血清蛋白質(zhì)分離的一般方法2.掌握鹽析法、凝膠層析分離純化白蛋白的方法實驗原理血清中主要蛋白：白蛋白與球蛋白正常人血清中總蛋白、白蛋白、球蛋白的量保持相對恒定；總蛋白60-80克/升，白蛋白為40-50克/升，球蛋白為20-30克/升。鹽析法中性鹽類能破壞溶液中蛋白分子表面的雙電子層和水膜，從而使蛋白質(zhì)從溶液中凝聚沉淀析出。利用白蛋白和球蛋白在高濃度中性鹽溶液中(常用硫酸銨)溶解度的差異而進行沉淀分離，此為鹽析法。血清白蛋白在飽和硫酸銨溶液中沉淀析出，血清球蛋白在半飽和硫酸銨溶液中沉淀析出。凝膠層析1、凝膠層析也稱凝膠過濾

2、，是一類利用有一定孔徑范圍的多孔凝膠的層析技術(shù)，是一種分子篩效應。2、當樣品流經(jīng)這類凝膠的固定相時，不同分子大小的各組分因進入網(wǎng)孔受阻滯的程度不同而以不同的速度通過層析柱，從而達到分離的目的。實驗步驟-硫酸銨鹽析取正常人血清2.0ml于小試管中，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液2.0ml，混勻后于室溫中放置10min，3000r／min離心10min。用滴管小心吸出上層清液于另一試管中，作為純化白蛋白之用。凝膠柱G-25層析除鹽1、裝柱：洗凈的層析柱垂直夾于鐵架上（有尼龍網(wǎng)孔的一頭朝下），將底部夾緊，注入約2.0ml的0.02mol/LPH6.5NH4Ac緩沖

3、液。將G-25疑膠攪成懸浮狀加入層析柱內(nèi)，慢慢打開柱底部出口，同時，不斷加入凝膠直至柱高25cm（裝柱時速度要均勻，不能分層，不得有氣泡，凝膠床表面要平整）。2、平衡：在凝膠柱床上留有3cm高的溶液，將層析柱底部旋緊，用0.02mol/LPH6.5NH4Ac緩沖液平衡20min，(防止柱床流干)。凝膠柱G-25層析除鹽3、洗脫：凝膠柱經(jīng)0.02mol/LPH6.5NH4Ac緩沖液平衡后，慢慢打開底口使凝膠床上的液面下降到與床面相齊（不低于凝膠床面），夾死底口。用吸管吸取樣品Ⅱ，小心緩慢的加到凝膠床面，打開底口，使樣品Ⅱ慢慢進入凝膠床面直至與床面相齊。吸取緩

4、沖液，沿壁慢慢加入凝膠床面，進行洗脫。4、收集：洗脫液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外檢測儀檢測蛋白峰并收集，為樣品Ⅲ，繪制洗脫曲線。凝膠柱G-75分離純化1、裝柱：洗凈的層析柱垂直夾于鐵架上（有尼龍網(wǎng)孔的一頭朝下），將底部夾緊，注入約2.0ml的0.02mol/LPH6.5NH4Ac緩沖液。將G-75疑膠攪成懸浮狀加入層析柱內(nèi)，慢慢打開柱底部出口，同時，不斷加入凝膠直至柱高25cm（裝柱時速度要均勻，不能分層，不得有氣泡，凝膠床表面要平整）。2、平衡：在凝膠柱床上留有3cm高的溶液，將層析柱底部旋緊，用0.02mol/LPH6.5NH

5、4Ac緩沖液平衡20min，(防止柱床流干)。凝膠柱G-75分離純化3、洗脫：凝膠柱經(jīng)0.02mol/LPH6.5NH4Ac緩沖液平衡后，慢慢打開底口使凝膠床上的液面下降到與床面相齊（不低于凝膠床面），夾死底口。用吸管吸取樣品Ⅲ，小心緩慢的加到凝膠床面，打開底口，使樣品Ⅲ慢慢進入凝膠床面直至與床面相齊。吸取緩沖液，沿壁慢慢加入凝膠床面，進行洗脫。4、收集：洗脫液用部分收集器收集（或者手工操作），每管2ml，用紫外檢測儀檢測蛋白峰并收集，為樣品Ⅳ，繪制洗脫曲線。紫外檢測儀工作原理儀器工作原理的依據(jù)是光吸收定律。從光源發(fā)出的光經(jīng)狹縫、濾光片、樣品池到光電培增管

6、上，使束由于樣品濃度不同所引起光強的變化轉(zhuǎn)換成光電流的變化，此光電流經(jīng)放大器輸入到對數(shù)轉(zhuǎn)換器，使透光率T轉(zhuǎn)成A輸出，即A=1g?-?=εCL式中ε為待測樣品的克分子消光系統(tǒng)，C為樣品濃度，采用克分子/升單位，L為光程，用厘米作單位。根據(jù)上式就知測出了A，就知樣品濃度C。若從放大器直接輸入記錄儀，繪出的是樣品透光率T變化的圖譜，若從對數(shù)轉(zhuǎn)換器輸入到記錄儀繪出的是樣品光密度A變化的圖譜。紫外檢測儀的使用量程范圍：0-100%T、0-2A、0-1A、0-0.5A、0-0.2A、0-0.1A、0-0.05A紫外檢測儀主要技術(shù)指標：1、調(diào)節(jié)光量旋鈕，量程旋鈕放置10

7、0%T檔，使LED數(shù)字顯示為100，T撥到A檔，使LED面板上讀數(shù)為0左右，若作透光度T測試，就可在層析柱上加樣，對樣品進行分離分析。2、若做光密度A測試，把量程旋鈕（即靈敏度）撥到所需光密度A，調(diào)節(jié)光量旋鈕，使LED面板為0。此時記錄儀回到零點附近（注：零點附近即可，在實驗中可自來定）。3、如繪出圖譜峰值過小，把量程旋鈕（即敏度）撥到所需位置。4、在測試過程中，“光量”均不再變動。測試完畢，并用蒸餾水清洗樣品池和管道。紫外檢測儀記錄儀1、量程一定用10mv。2、走紙速度：G25，2A，5cm；G75,1A，1-2cm。紫外檢測儀使用方法：1、首先將主機和

8、記錄儀二部分電路接妥，然后把主機的電源插頭插入220V電源插座上。