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1、豬血清IgG的分離純化及鑒定組員：張健湯敏龍陳玉玲匯報人：陳小堅Contents材料與方法結(jié)果與討論總結(jié)與感想2一、材料與方法（一）試驗材料1、供試材料采用豬血為實驗材料，采自寧波方興食品有限公司屠宰場。收集健康肉豬頸動脈血液，室溫下放置1-2h，析出血清，于4℃、8000r/min離心10min，除去血球和纖維蛋白原后，取上層血清，-20℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?2、主要試劑試劑名稱規(guī)格出產(chǎn)廠家三氯醋酸正辛酸氯化鈉氫氧化鈉鹽酸Tris無水乙醇醋酸分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純上海光鏵科技有限公司衢州巨化試劑有限公司天津市永大化學(xué)試
2、劑開發(fā)中心上海三鷹化學(xué)試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司杭州瓶窯和順化工試劑廠浙江中星化工試劑有限公司4試劑名稱規(guī)格出產(chǎn)廠家考馬斯亮藍甘油巰基乙醇SDS甘氨酸溴酚藍DEAE52過硫酸銨乙酸鋇分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純分析純浙江中星化工試劑有限公司無錫市龍吉化工試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司上海源聚生物科技有限公司天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心浙江中星化工試劑有限公司安徽三星樹脂科技有限公司上海三鷹化學(xué)試劑有限公司浙江中星化工試劑有限公司53、儀器設(shè)備儀器名稱型號生產(chǎn)廠家紫外可見分光光度計S52恒
3、達儀器廠電泳儀CS101上海精密科學(xué)儀器有限公司低速大容量離心機TDL-5上海安亭科學(xué)儀器廠高速萬能粉碎機FW100天津市泰斯特儀器有限公司數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-2常州國華電器有限公司真空干燥箱DZF-6050上海一恒科技有限公司電子精密天平AB-L梅特勒－托利多儀器有限公司全溫振蕩（空氣）培養(yǎng)箱QYC-211上海?，攲嶒炘O(shè)備有限公司自動液相色譜分離層析儀MC99-3上海滬西分析儀器廠電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱OHG-907385-Ⅲ上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司酸度計DELTA-320梅特勒托利多儀器(上海)有限公司層析拄Φ1.0×30上海滬西分析儀器廠
4、恒溫磁力攪拌器90-2上海亞榮生化儀器廠6A豬血清IgG的提取B豬血清IgG的純化C提取液蛋白含量測定（二）試驗方法D豬血清IgG分子量測定71、豬血清IgG的提取——正辛酸法準(zhǔn)確量取豬血清40mL于500mL燒杯中，加入60mmol/LpH4.0醋酸緩沖液160mL，用氫氧化鈉溶液調(diào)pH4.5。以每毫升稀釋液加入25μL正辛酸的比例，在磁力攪拌條件下緩慢加入正辛酸，室溫攪拌30min，4℃，5000r/min離心30min，棄去沉淀。上清液4℃預(yù)冷，以1mL上清液加0.227g硫酸銨的比例，緩慢加入硫酸銨粉末，邊加邊攪拌，室溫下繼續(xù)攪拌30m
5、in，5000r/min離心15min。將沉淀溶于20mL生理鹽水中，透析過夜，離心去沉淀，上清液即為粗提IgG。82、豬血清IgG的純化將上述IgG粗品溶于少量生理鹽水后裝入透析袋，懸于裝有0.01mol/L，pH7.4的PBS的大燒杯中，于磁力攪拌器上4℃透析24h，每6h換一次液。（1）透析脫鹽9取2g預(yù)處理的DEAE-52纖維素、裝成1.5×30cm，柱床高25cm層析柱。緩沖液A(25mmol/LTris-HCl，pH8.8，35mmol/LNaCl)平衡。取2mL上述透析去鹽母液進層析柱，上樣后先用緩沖液A平衡，至流出液在280nm
6、波長洗脫曲線變得平直止。以等量緩沖液A和緩沖液C(25mmol/LTris-HCl，pH8.8，500mmol/LNaCl)連續(xù)梯度洗脫；控制流速1mL/min。上樣15min后分步收集并記錄波峰，2mL/管，合并同一波峰收集管。再用PBS溶液透析，并進行分析鑒定。（2）DEAE-52纖維素離子交換層析純化IgG103、提取液蛋白含量測定——Folin-酚法配制標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白進行Folin-酚法實驗，用分光光度計測定梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)蛋白的OD280。以蛋白質(zhì)的濃度為橫坐標(biāo)，OD280值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。各粗IgG樣品液定容至100mL，按F
7、olin-酚法操作，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的蛋白質(zhì)濃度。114、豬血清IgG分子量測定——SDS-PAGE配制SDS-PAGE凝膠。將透析過的IgG樣品液和標(biāo)準(zhǔn)蛋白液與上樣緩沖液混合后在沸水浴中加熱5min，各取20μL加入凝膠板的樣品槽中，進行電泳。取出凝膠平板，將凝膠浸泡在染色液中，20min后用脫色液脫色。脫色后的凝膠在凝膠成像儀上拍照，分析，根據(jù)標(biāo)樣做出標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品IgG分子量。12電泳設(shè)備13二、結(jié)果與討論（一）正辛酸提取豬血清IgG試驗結(jié)果血清提取出的球蛋白粗品為淺黃色膠狀物質(zhì)。（二）豬血清IgG純化結(jié)果透析后的蛋白質(zhì)顏色明顯變淺
8、，呈透明狀。1、IgG的透析結(jié)果14保留時間0-1.6h為緩沖液A洗脫第一峰；1.6h開啟緩沖液A-C線性梯度洗脫，獲得第二峰；圖示兩色譜峰分離效果較
