細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述

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1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)概述無菌操作基本技術(shù)1.實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前，無菌室及無菌操作臺(tái)(laminarflow)以紫外燈照射30-60分鐘滅菌，以70%ethanol（乙醇）擦拭無菌操作抬面，并開啟無菌操作臺(tái)風(fēng)扇運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘后，才開始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞株，且即使培養(yǎng)基相同亦不共享培養(yǎng)基，以避免失誤混淆或細(xì)胞間污染。實(shí)驗(yàn)完畢后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)，以70%ethanol擦拭無菌操作抬面。操作間隔應(yīng)讓無菌操作臺(tái)運(yùn)轉(zhuǎn)10分鐘以上后，再進(jìn)行下一個(gè)細(xì)胞株之操作。2.無菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔及寬敞，必要物品，例如試管架、吸管吸取器或吸管

2、盒等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完即應(yīng)移出，以利于氣流之流通。實(shí)驗(yàn)用品以70%ethanol擦拭后才帶入無菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在抬面之中央無菌區(qū)域，勿在邊緣之非無菌區(qū)域操作。3.小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋的蓋口朝上放置桌面。4.工作人員應(yīng)注意自身之安全，須穿戴實(shí)驗(yàn)衣及手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來自人類或是病毒感染之細(xì)胞株應(yīng)特別小心操作，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)之無菌操作臺(tái)(至少ClassII)。操

3、作過程中，應(yīng)避免引起aerosol（浮質(zhì)）之產(chǎn)生，小心毒性藥品，例如DMSO及TPA等，并避免尖銳針頭之傷害等。5.定期檢測(cè)下列項(xiàng)目：5.1.CO2鋼瓶之CO2壓力5.2.CO2培養(yǎng)箱之CO2濃度、溫度、及水盤是否有污染(水盤的水用無菌水，每周更換)。5.3.無菌操作臺(tái)內(nèi)之a(chǎn)irflow壓力，定期更換紫外線燈管及HEPA過濾膜，預(yù)濾網(wǎng)(300小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000小時(shí)/HEPA)。6.水槽可添加消毒劑(Zephrin1:750)，定期更換水槽的水。實(shí)驗(yàn)用品1.種類︰1.1.細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)用品均為無菌，除了玻璃容器與pasteur

4、pipet（巴斯德移液管）外，其它均為塑料無菌制品。1.2.TC級(jí)培養(yǎng)盤（高透明衛(wèi)生級(jí),SEBS氫化級(jí),優(yōu)良的物性,可包膠PP,舒適的手感,適用于高檔產(chǎn)品）表面均有coating高分子物質(zhì)以讓細(xì)胞吸附，培養(yǎng)容器種類有Tflask,plates,dishes,rollerbottle等，依實(shí)驗(yàn)需要使用。1.3.plasticsterile（不生育的;貧瘠的；消過毒的,無菌的）pipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料離心管:15ml,50ml，均有2種不同材質(zhì)，其中polypropylene(PP)為不透

5、明材質(zhì)，polystyrene(PS)為透明材質(zhì)，可依實(shí)驗(yàn)需要而選擇適合材質(zhì)之離心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉廢棄培養(yǎng)液等。1.6.玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,500ml,1000ml2.清洗︰2.1.新購玻璃血清瓶先以0.1~0.05NHCl浸泡數(shù)小時(shí)，洗凈后才開始使用。2.2.用過之玻璃血清瓶，以高壓蒸汽滅菌，洗凈后分別用一次與二次去離子水沖洗干凈，勿加清潔劑清洗。3.滅菌︰3.1.實(shí)驗(yàn)用玻璃血清瓶以鋁箔紙包覆瓶蓋，高壓蒸汽滅菌1

6、21oC,15lb,20min，置于oven中烘干。3.2.實(shí)驗(yàn)用玻璃pasteurpipet以干熱滅菌170oC,4小時(shí)。3.3.液體或是固體廢棄物可用10%hypochloride溶液(次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高壓滅菌121oC,15lb,20min處理。培養(yǎng)基1.液體培養(yǎng)基貯存于4oC冰箱，避免光照，實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前放在37oC水槽中溫?zé)帷?.液體培養(yǎng)基(加血清)存放期為六個(gè)月，期間glutamine（谷氨酰胺）可能會(huì)分解，若細(xì)胞生長(zhǎng)不佳，可以再添加適量glutamine。3.粉末培養(yǎng)基配制(以1升為例)：3.1.細(xì)胞培養(yǎng)基

7、通常須添加10%血清，因此粉末培養(yǎng)基之配制體積為900ml，pH為7.2-7.4。NaHCO3為另外添加，若將NaHCO3粉末直接加入液體培養(yǎng)基中會(huì)造成pH之誤差，或局部過堿。因此粉末培養(yǎng)基及NaHCO3粉末應(yīng)分別溶解后才混合，然后用CO2氣體調(diào)整pH，而非用強(qiáng)酸(HCl)或強(qiáng)堿(NaOH)，因?yàn)槁入x子對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)可能有影響，且貯存時(shí)培養(yǎng)基的pH易發(fā)生改變。3.2.材料：3.2.1.純水(milli-Q水或二次至三次蒸餾水，水品質(zhì)非常重要)3.2.2.粉末培養(yǎng)基3.2.3.NaHCO3(SigmaS-4019)3.2.4.電磁攪

8、拌器3.2.5.無菌血清瓶3.2.6.0.1或0.2mm無菌過濾膜3.2.7.pHmeter3.2.8.真空幫浦3.2.9.CO2氣體3.3.步驟：3.3.1.取粉末培養(yǎng)基溶于700mlmilli-Q水中，攪拌使其溶解。3.3.2.稱取適量之NaHCO3粉末(數(shù)量依培養(yǎng)基種類