細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)

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1、細(xì)胞培養(yǎng)CellCulture2第四章細(xì)胞培養(yǎng)的基本技術(shù)4.1基本操作技術(shù)和要求3培養(yǎng)前準(zhǔn)備制訂試驗(yàn)計(jì)劃和操作程序準(zhǔn)備各種器材物品培養(yǎng)室和超凈臺(tái)的消毒0.2%新潔爾滅托洗地面紫外燈照射30-60分鐘以75%乙醇擦拭無菌操作臺(tái)面培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作4洗手和著裝徹底洗手以75%乙醇消毒手和前臂可穿經(jīng)紫外線照射30min的一般清潔工作服。無菌培養(yǎng)操作一切操作都應(yīng)在火焰近處并經(jīng)過灼燒進(jìn)行。小心取用無菌之實(shí)驗(yàn)物品，避免造成污染。勿碰觸吸管尖頭部或是容器瓶口，亦不要在打開之容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開后，以手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上

2、放置桌面。培養(yǎng)室內(nèi)的無菌操作5678910無菌操作中常犯的錯(cuò)誤吸管、剪刀等碰到其他器皿11無菌操作中常犯的錯(cuò)誤正確的拿管姿勢(shì)錯(cuò)誤的拿管姿勢(shì)拿吸管時(shí)手碰到無菌區(qū)！12無菌操作中常犯的錯(cuò)誤培養(yǎng)基浸濕吸管底部的棉花134.2原代培養(yǎng)14將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過程稱為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。細(xì)胞

3、和組織培養(yǎng)15計(jì)數(shù)細(xì)胞細(xì)胞數(shù)/ml=計(jì)數(shù)16格×稀釋倍數(shù)×10416原理：（1）計(jì)算細(xì)胞數(shù)目可用血球計(jì)數(shù)盤或是Coultercounter粒子計(jì)數(shù)器自動(dòng)計(jì)數(shù)。（2）血球計(jì)數(shù)盤一般有二個(gè)chambers，每個(gè)chamber中細(xì)刻9個(gè)1mm2大正方形，其中4個(gè)角落之正方形再細(xì)刻16個(gè)小格，深度均為0.1mm。當(dāng)chamber上方蓋上蓋玻片后，每個(gè)大正方形之體積為1mm2×0.1mm=1.0x10-4ml。使用時(shí)，計(jì)數(shù)每個(gè)大正方形內(nèi)之細(xì)胞數(shù)目，乘以稀釋倍數(shù)，再乘以104，即為每ml中之細(xì)胞數(shù)目。（3）存活測(cè)試之步驟為dyeexclusion（染料排除），利用染

4、料會(huì)滲入死細(xì)胞中而呈色，而活細(xì)胞因細(xì)胞膜完整，染料無法滲入而不會(huì)呈色。一般使用藍(lán)色之trypanblue染料，如果細(xì)胞不易吸收trypanblue，則用紅色之Erythrosinbluish。計(jì)算細(xì)胞活率：活細(xì)胞數(shù)/（活細(xì)胞數(shù)+死細(xì)胞數(shù)）×100%。計(jì)數(shù)應(yīng)在臺(tái)盼蘭染色后數(shù)分鐘內(nèi)完成，隨時(shí)間延長(zhǎng)，部分活細(xì)胞也開始攝取染料；因?yàn)榕_(tái)盼蘭對(duì)蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的親和力，用不含血清的稀釋液，可以使染色計(jì)數(shù)更為準(zhǔn)確。17兩個(gè)概念原代培養(yǎng)直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱為原代培養(yǎng)，而改稱為細(xì)胞系。

5、傳代培養(yǎng)細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無限地傳代下去。18培養(yǎng)細(xì)胞的取材理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。19組織塊培養(yǎng)法新鮮取材的組織中細(xì)胞仍具有分裂增殖的能力。將組織切成小塊培養(yǎng)在模擬體內(nèi)的環(huán)境中，小塊組織的細(xì)胞可以游離出來，從培養(yǎng)液中吸取營(yíng)養(yǎng)，繼續(xù)分裂生長(zhǎng)。組織塊培養(yǎng)法適用范圍廣，常用于肝臟、

6、皮膚、角膜、骨骼、韌帶、血管、神經(jīng)、心臟等器官和組織的培養(yǎng)。5820212223242526培養(yǎng)要點(diǎn)材料新鮮嚴(yán)格無菌操作剔除脂肪等附著組織組織塊剪?。ㄖ睆僵?mm）擺放開（間距﹥5mm）27常犯的錯(cuò)誤操作中不換器械沖洗次數(shù)不夠組織碎片太大組織塊擺放太密培養(yǎng)液加入太多28消化培養(yǎng)法消化培養(yǎng)法所用的酶有多種，目前應(yīng)用最廣的是胰蛋白酶。它是一種內(nèi)切酶，可專一水解有精胺酸或賴氨酸的羧基形成的肽鍵。從而消除妨礙細(xì)胞生長(zhǎng)的細(xì)胞間質(zhì)，包括基質(zhì)、纖維等，使細(xì)胞分散，易于貼壁并從外界吸收養(yǎng)分和排除代謝物消化法適用于組織量大的原代培養(yǎng)。胰蛋白酶液適用于消化間質(zhì)少的組織，如羊

7、膜、胚胎、上皮、肝和腎等組織及傳代細(xì)胞。592955切成1--2mm3小塊20--60min30313233343536培養(yǎng)要點(diǎn)36合適的胰蛋白酶濃度（通常為0.25%）合適的消化時(shí)間：消化時(shí)，待組織塊變得較疏松，顏色略白為止（通常為37℃，20-40分鐘）37常犯的錯(cuò)誤水浴鍋未預(yù)熱組織塊太大38胰蛋白酶消化不足或過度吹打用力過重常犯的錯(cuò)誤394.3傳代培養(yǎng)和細(xì)胞系的維持40傳代細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞在原培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的操作叫傳代。為獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株，或大量的同種細(xì)胞，當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞形成致密的單層后需進(jìn)行傳代培養(yǎng)。6341首次傳代注意事項(xiàng)細(xì)胞沒有生長(zhǎng)

8、到足以覆蓋瓶底壁的大部分表面以前（80%），不要急于傳代。傳代時(shí)不同的細(xì)胞有不同