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1、細胞培養(yǎng)基本技術(shù)ustcwhm@ustc.edu.cnhttp://biox.ustc.edu.cn→科研實驗室→免疫學(xué)研究所→PPT下載1無菌操作技術(shù)體外培養(yǎng)細胞缺乏抗感染能力，所以防止污染是決定培養(yǎng)成功或失敗的首要條件。即便使用設(shè)備完善的實驗室，若實驗者粗心大意，技術(shù)操作不規(guī)范,也會導(dǎo)致污染。因而,為在一切操作中最大可能地保證無菌，每一項工作都必須做到有條不紊和完全可靠。2Termstoremember:Termstoremember消毒(disinfection)和消毒劑(disinfectant)滅菌(sterilization)防腐(antisep
2、sis)和防腐劑抑菌(bacteriostasis)和抑菌劑(bacteriostatic)無菌(asepsis)無菌技術(shù)/無菌操作(antiseptictechnique)3無菌操作技術(shù)1.工作環(huán)境及表面的處理2.細胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理3.實驗者的操作技術(shù)4.培養(yǎng)液的處理4無菌技術(shù)概念?無菌技術(shù)?無菌區(qū)是指在醫(yī)療、護理操是指在醫(yī)療、護理操是指經(jīng)過滅菌處理是指經(jīng)過滅菌處理作過程中，防止一切作過程中，防止一切是指未經(jīng)過滅菌處理是指未經(jīng)過滅菌處理是指無菌物品自無菌是指無菌物品自無菌?非無菌區(qū)且未被污染的區(qū)域。，或雖經(jīng)過滅菌處理且未被污染的區(qū)域。，或雖經(jīng)
3、過滅菌處理是指經(jīng)過物理或化學(xué)是指經(jīng)過物理或化學(xué)是指未經(jīng)處理或消毒是指未經(jīng)處理或消毒微生物侵入人體和防微生物侵入人體和防容器內(nèi)一經(jīng)取出，就容器內(nèi)一經(jīng)取出，就方法滅菌后保持無菌方法滅菌后保持無菌?相對無菌區(qū)止無菌物品、無菌區(qū)止無菌物品、無菌區(qū)但又被污染的區(qū)域。但又被污染的區(qū)域。認為是相對無菌，不認為是相對無菌，不滅菌后又被碰臟的物滅菌后又被碰臟的物狀態(tài)的物品。狀態(tài)的物品。?無菌物品域被污染的技術(shù)。域被污染的技術(shù)。品。品?？稍俜呕?。可再放回。無菌區(qū)邊緣向內(nèi)無菌區(qū)邊緣向內(nèi)3cm3cm?污染物品為相對無菌區(qū)。為相對無菌區(qū)。5【培養(yǎng)前準(zhǔn)備】在開始實驗前要制定好實驗計劃和
4、操作程序。有關(guān)數(shù)據(jù)的計算要事先做好。根據(jù)實驗要求，準(zhǔn)備各種所需器材和物品、清點無誤后將其放置操作場所(培養(yǎng)室、超凈臺)內(nèi)，然后開始消毒。這可以避免開始實驗后，因物品不全往返拿取而增加污染機會。6【操作野消毒】無菌培養(yǎng)室每天都要用0.2%的新潔爾滅拖洗地面—次(拖布要專用)，紫外線照射消毒30-50min，超凈工作臺臺面每次實驗前要用75％酒精擦洗。然后紫外線消毒30min。在工作臺面消毒時切勿將培養(yǎng)細胞和培養(yǎng)用液同時照射紫外線，消毒時工作臺面上用品不要過多或重疊放置，否則會遮擋射線降低消毒效果。—些操作用具如移液器、廢液缸、污物盒、試管架等用75%酒精擦洗后
5、置于臺內(nèi)同時紫外線消毒。7【洗手和著裝】原則上和外科手術(shù)相同。平時僅做觀察不做培養(yǎng)操作時，可穿著細胞培養(yǎng)室內(nèi)紫外線照射30min的清潔工作服。在利用超凈臺工作時，因整個前臂要伸入箱內(nèi)，應(yīng)著長袖的清潔工作服，并于開始操作前要用75％酒精消毒手。如果實驗過程中手觸及可能污染的物品和出入培養(yǎng)室都要重新用消毒液洗手。進入原代培養(yǎng)室需徹底洗手還要戴口罩、著消毒衣帽。891011【火焰消毒】在無菌環(huán)境進行培養(yǎng)或做其它無菌工作時，首先要點燃酒精燈。以后一切操作，如按裝吸管帽、打開或封閉瓶口等，都需在火焰近處并經(jīng)過燒灼進行。培養(yǎng)瓶試管培養(yǎng)皿滴管吸管12【操作】進行培養(yǎng)時，動
6、作要準(zhǔn)確敏捷，但又不必太快，以防空氣流動，增加污染機會。不能用手觸及已消毒器皿，如已接觸，要用火焰燒灼消毒或取備品更換。接種環(huán)、接種針L形涂布棒13培養(yǎng)細胞的觀察１．肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度14體外培養(yǎng)細胞的常見問題15161718２．倒置顯微鏡觀察細胞生長狀態(tài)19體外培養(yǎng)細胞的方式群體培養(yǎng)（massculture），將含有一定數(shù)量細胞的懸液置于培養(yǎng)瓶中，讓細胞貼壁生長，匯合（confluence）后形成均勻的單細胞層；克隆培養(yǎng)（clonalculture），將高度稀釋的游離細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中，各個細胞貼壁后，彼此距離較遠，經(jīng)過生長增殖每一個細胞形成一個
7、細胞集落，稱為克?。╟lone）。一個細胞克隆中的所有細胞均來源于同一個祖先細胞。20群體培養(yǎng)（左）和克隆培養(yǎng)（右）21體外培養(yǎng)細胞的分型（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：221、成纖維細胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。23名稱：凡在培養(yǎng)中形態(tài)與成纖維細胞類似的來源：由中胚層
8、間充質(zhì)組織起源的組織如：真正的成纖維細胞，心肌，平滑
