細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)

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1、細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室張華屏主要內(nèi)容體外培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖特點(diǎn)培養(yǎng)細(xì)胞所用的實(shí)驗(yàn)用品常用的培養(yǎng)器皿及其清洗消毒與滅菌液體的配置（培養(yǎng)基，平衡緩沖液，消化液等）細(xì)胞的處理（傳代，凍存和復(fù)蘇）體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型(一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞屬于貼附生長(zhǎng)，貼壁依賴性細(xì)胞（二）懸浮型；見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類細(xì)胞容易大量繁殖。血管內(nèi)皮細(xì)胞胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生命期（LifeSpanofCultureCells)，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與

2、完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間。（一）培養(yǎng)細(xì)胞的生命期培養(yǎng)細(xì)胞的生命期和細(xì)胞的種類、性狀和原供體的年齡等情況有關(guān)。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維持一年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短。1．原代培養(yǎng)期（PrimaryCulture）也稱初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織，接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代

3、培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大，細(xì)胞群是異質(zhì)的。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型。由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。2．傳代期初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代便改稱為細(xì)胞系（CellLine）。在全生命期中此期持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱二倍體細(xì)胞系（DiploidCellLine）。3．衰退期此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（

4、SpontaneousTransformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱無(wú)限細(xì)胞系（InfiniteCellLine），也稱連續(xù)細(xì)胞系（ContinuousCellLine）。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期所謂細(xì)胞“一代”一詞，指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generati

5、on）或倍增〔Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：1.潛伏期細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱貼壁，懸浮期結(jié)束。細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)

6、潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。2．指數(shù)增生期（LogarithmicgrowthPhase）：這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱接觸抑制（ContactInhibition）。而惡性細(xì)胞則無(wú)

7、接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無(wú)接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piledup）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（DensityInhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應(yīng)混淆。3．停滯期（StagnatePhase）細(xì)胞數(shù)