dna分子克隆技術(也稱基因克隆技術)

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1、DNA分子克隆技術（也稱基因克隆技術）：在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細胞獲得大量拷貝的過程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性內(nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導入宿主細胞→篩選、鑒定→擴增和表達。載體（vecors）在細胞內(nèi)自我復制，并帶動重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫，一種是基因組文庫（genomiclibrary）,另一種是cD

2、NA庫。載體　所謂載體是指攜帶靶DNA片段進入宿主細胞進行擴增和表達的工具。細菌質(zhì)粒是一種細菌染色體外小型雙鏈環(huán)狀結(jié)構的DNA，分子大小為1-20kb，對細菌的某些代謝活動和抗藥性表型具有一定的作用。質(zhì)粒載體是在天然質(zhì)粒的基礎上人工改造拼接而成。最常用的質(zhì)粒是pBR322?；驇斓慕ㄔ旌心撤N生物體全部基歷的隨機片段的重組DNA克隆群體，其含有感光趣的基因片段的重組子，可以通過標記探針與基因庫中的重組子雜交等方法而篩選出來，所得到的克隆經(jīng)過純化和擴增，可用于進一步的研。其主步驟包括：（1）構建基因庫迅速的載體；(2)DNA片段的制備；（3）DNA片段與載體DNA的連接；（4）包裝

3、和接種。cDNA庫的建造是指克隆的DNA片段，是由逆轉(zhuǎn)錄酶自mRNA制備的cDNA。cDNA庫包括某特定細胞的全部cDNA克隆的文庫，不含內(nèi)含子。特異基因的篩選常用的方法有：（1）克隆篩選即探針篩選法；（2）抗體檢測法，檢測其分泌蛋白質(zhì)來篩選目的基因；（3）放射免疫篩選法，查出分泌特異抗原的基因；（4）免疫沉淀法，進行特異基因的篩選。核酸序列測定DNA的堿基序列決定著基因的特性，DNA序列分析（測序，sequencing）是分子生物學重要的基本技術。無論從基因庫中篩選的癌基因或經(jīng)PCR法擴增的基因，最終均需進行核酸序列分析，可藉以了解基因的精細結(jié)構，獲得其限制性內(nèi)切酶圖譜，分析基

4、因的突變及對功能的影響，幫助人工俁成基因、設計引物，以及研究腫瘤的分子發(fā)病機制等。測序是在高分辨率變性聚丙烯酰胺凝膠電泳技術的基礎上建立起來的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化學降解少和Sanger的雙脫氧法等，近年來已有DNA序列自動測定儀問世?；瘜W降解法是在DNA的片段的5`端標記核素，然后用專一性化學試劑將DNA特異地降解，在電泳和自顯影后，可得到從標記端延伸的片段供測讀序列和進行比較。一般能讀出200-250個核苷酸序列。雙脫氧法是采用核苷酸鏈終止劑，如：2`，3`-雙脫氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一種)摻入

5、到DNA鏈中以終止鏈的延長，與摻入4種正常的dNTP的混合物分成四組進行反應，這樣可得到一組結(jié)尾長衙不一、不同專一性核苷酸鏈終止劑結(jié)尾的DNA片段，經(jīng)凝膠電泳分離和放射自顯影，可讀出合成的DNA核苷酸序列，根據(jù)堿基互補原則，可推算出模板DNA分子的序列?；瘜W降解法只需一化學試劑，重復性好，容易掌握；而雙脫氧法需單鏈模板、特異的寡核苷酸引物及高質(zhì)量的DNA聚合酶，便隨著M13噬菌體載體的發(fā)明和運用，合成的引物容易獲得，測序技術不斷改進，故此法已被廣泛應用?；撗醴ǖ淖詣蛹す鉄晒鉁y序儀，使測工作更快速和簡便，而且保證高度重復性。至于RNA測序現(xiàn)大多采用將mRNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后同測

6、序，然后反推RNA序列分子克隆技術通常特指基因克?。╣enecloning）或DNA重組技術（recombinantDNAtechnology）?；蚩寺≈饕ǎ孩龠B接外源基因和克隆載體，構建重組DNA分子，②將重組DNA分子轉(zhuǎn)入受體細胞，使外源基因隨受體細胞分裂而得以復制、繁殖。　　一、基因克隆的基本方法　　一個典型的基因克隆實驗，主要有以下操作和結(jié)果：　?。?）包括有目的基因在內(nèi)的DNA片斷插入另一個DNA分子（克隆載體，通常是環(huán)狀的），形成重組DNA分子。　?。?）重組DNA分子通過轉(zhuǎn)化或其他類似的方法被導入受體細胞。大腸桿菌是使用較多的受體細胞?！　。?）在受體細胞中，

7、克隆載體指導重組DNA分子復制，產(chǎn)生許多完全相同的拷貝?！　。?）當受體細胞分裂時，重組DNA分子的拷貝進入子細胞，克隆載體的復制將在子細胞中繼續(xù)?！　。?）大量分裂的受體細胞形成克?。阂粋€細胞群體，其中每個細胞都含有許多重組DNA分子的拷貝。　　顯而易見，基因克隆是一個比較直觀而簡單的操作程序。它之所以具有非常重要的生物學意義，是因為這一技術可以為我們提供一個純粹的基因標本。通常，一個基因總是和細胞里其他基因同在。基因克隆技術誕生之前，我們根本無法純化單個基因，這意味著我們只能