分子克隆技術.doc

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1、實驗操作手冊2005生命科學技術學院課程簡介分子克隆技術是指DYA的無性繁殖技術。分子克隆技術課程主要是針對生物技術專業(yè)、生物科學專業(yè)、生命科學與技術基地班本科生及生物學類專業(yè)研究生而開設的實驗課。實驗內容涉及分子克隆的一些基本方法及基本操作技巧，主要包括分子克隆和分子雜交兩大部分：分子克隆技術：。"重組技術是分子生物學的核心內容。本實驗利用質粒載體克隆外源DNA片段，通過這個實驗大家可以掌握質粒載體的抽提、外源DNA的準備、酶切、連接及感受態(tài)細胞的制備、連接產物的轉化以及陽性克隆子的鑒定和驗證

2、等。分子雜交技術：實驗室常用的分子雜交技術主要有Southernblotting,Northernblotting,Westernblotting及Dotblotting等。Southernblotting是通過用一種或多種限制性內切酶消化基因組或其它來源的DNA,經過瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后DNA在原位發(fā)生變性并從凝膠轉移到一固和支持物上（硝酸纖維素膜或尼龍膜）。DNA轉移至同相支持物的過程屮各DM的相對位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素）標記的DNA探針與固著在膜上的

3、DNA雜交，經X-光片自顯影顯現(xiàn)出與探針DNA互補的DNA電泳條帶的位置，然后進行分析。本實驗要求掌握植物總DNA的抽提、質量檢測、限制性內切酶操作、DNA的瓊脂糖凝膠電泳、轉膜、探針的制備、同位素操作等方面的實驗技術。在轉錄水平上研究和了解基因的表達與調控是分子生物學和基因操作的重要內容。為讓學生初步了解有關RNA的操作過程注意事項，我們還列出Northernblotting的操作步驟以供選擇。系歹U一分子克隆技術4實驗一質粒的制備4實驗二DNA的瓊脂糖凝膠電泳5實驗三外源DNA片段在質粒載體中

4、的克隆7實驗四感受態(tài)細胞的制備9CaC12感受態(tài)細胞的制備實驗步驟9電轉化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟10實驗五質粒的轉化及轉化子的鑒定11熱激法轉化實驗步驟：11質粒電轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞操作步驟12實驗六PCR技術12系歹I匚Southern雜交技術14實驗一植物總DNA的快速少量抽提(CTAB法)14實驗二總DNA質量檢測及酶切15實驗三電泳、轉膜16實驗四SouthernBlottingis系列三NorthernBlotting24實驗一RNAExtraction(miniprep

5、)24實驗二RT-PCR(ReversetranscriptionPCR)26實驗三RNA的電泳，轉膜和雜交28附錄試劑配方29一細菌培養(yǎng)試劑30二質粒抽提試齊U30%1DNA操作試齊I」31%1RNA操作試劑34StockSolution:34WorkSolution35系列一分子克隆技術實驗1質粒的制備質粒是攜帶外源基因進入細菌屮擴增或表達的主要載體，它在基因操作屮具有重要作用。質粒的分離與提取是最常用、最基本的實驗技術。質粒的提取方法很多，大多包插3個主要步驟：細菌的培養(yǎng)、細菌的收集和裂解、

6、質粒DNA的分離和純化。本實驗以堿裂解法為例，介紹質粒的抽提過程。實驗目的：掌握堿裂解法抽提質粒的原理、步驟及各試劑的作用。實驗材料：含有質粒pUC18載體的大腸桿菌菌液，克隆有水稻外源片段的BAC的大腸桿菌菌液。實驗原理：在pH12.0?12.6堿性環(huán)境屮，細菌的線性大分子量染色體DNA變性分開，而共價閉環(huán)的質粒DNA雖然變性但仍處于拓撲纏繞狀態(tài)。將pH調至屮性并有高鹽存在及低溫的條件下，大部分染色休DNA、大分子量的RNA和蛋白質在去污劑SDS的作用下形成沉淀，而質粒DNA仍然為可溶狀態(tài)。通過

7、離心，可除去大部分細胞碎片、染色體DNA、RNA及蛋白質，質粒DNA尚在上清屮，然后用酚、氯仿抽提進一步純化質粒DNA。實驗步驟：1.取含有pUC18質粒的大腸桿菌菌液于LA培養(yǎng)基上37°C過夜培養(yǎng)；2.用無菌牙簽挑取單菌落，接種于含有Amp抗生素的LB培養(yǎng)基屮，37°C搖床?250r/min過夜培養(yǎng)；3.吸取1.5ml菌液,12000g離心2分鐘，收集菌體，倒掉菌液;吸取1.5ml菌液,再次收集菌體，盡量將菌液倒干凈；4.加入300山溶液I振蕩打勻，重新懸浮細胞，震蕩混勻（注意：應徹底打勻沉淀或

8、碎塊）；5.加入300pl溶液H,輕柔顛倒混勻，放置至清亮，一般不超過5分鐘；6.加入300』溶液顛倒混勻，放置于冰上10分鐘，使雜質充分沉淀；7.12000g離心10分鐘；1.吸取800卩1上清液（注意：不要吸取到飄浮的雜質）至另一Eppendorf管屮，加入2/3體積的界內醇，室溫下放置5分鐘；2.12000g常溫離心15分鐘;3.倒盡上清，加75%乙醇浸洗除鹽（放置片刻或離心3分鐘后倒去上清）；4.室溫放置或超凈臺上風干DNA；5.加40pl滅菌超純水或TE溶解；6.質粒、B